微卫星Mfd41和DCC的遗传不稳定性与慢性粒细胞白血病病程发展关系研究

中华血液学杂志 1998年第8期第19卷 论　著

作者：李戈　宋玉华　钱林生　马小彤

单位：300020　天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所

　　关键词： 聚合酶链反应；微卫星遗传不稳定性；杂合性缺失；白血病,髓细胞性,慢性

　　摘要　目的:研究微卫星DNAs的遗传不稳定性与慢性粒细胞白血病(CML)加速、急变的关系。方法:采用基础PCR-银染方法对9例加速期和8例急变期CML患者的骨髓细胞与其慢性期标本位于染色体17p的Mfd41和18q的DCC两个微卫星序列进行比较分析。结果:17例CML加速期或急变期患者中有8例出现微卫星不稳定性(MSI)或杂合性丢失(LOH),占总病例数的47.5%。6例(加速期2例,急变期4例)出现DCC改变,占总病例数的35.3%；2例(加速期和急变期各1例)出现Mfd41改变,占总病例数的11.8%。结论:微卫星DNAs的遗传不稳定性可能参与CML加速或急变的演变。

　　Genetic instability of microsatellites Mfd41 and DCC in the evolution of chronic myelogenous leukemia　Li Ge, Song Yuhua, Qian Linsheng,et al. Institute of Hematology, CAMS and PUMC, Tianjin　300020

　　Abstract　Objective: To explore the relationship between the genetic instability of microsatellite and the evolution of chronic myelogenous leukemia(CML).Methods:The loss of heterozygosity(LOH) and the microsatellite instability(MSI) of two polymorphic microsatellite markers, DCC and Mfd41,which located on chromosome 18q and 17p respectively, were assayed by standard PCR-silver staining analysis in bone marrow cells from 17 CML patients progressing from chronic phase to accelerated phase or blast crisis. Results: LOH or MSI of the two microsatellites were demonstrated in 8/17 (47.5%) patients in accelerated/blastic phases. For DCC, genetic instability was revealed in 2 of 9 patients in accelerated phase and in 4 of 8 in blast crisis. For Mfd41, genetic instability was revealed in 1 of 9 patients in accelerated and in 1 of 8 in blast crisis. Conclusion: Genetic instability of DCC and Mfd41 may play a role in the evolution of CML.

　　Key word　 Polymerase chain reaction　　Microsatellite Instability　　 Loss of heterozygosity　　Leukemia,myeloid,chronic

　　由t(9;22)易位所产生的bcr/abl融合基因,是慢性粒细胞白血病(CML)的特征性分子标志。CML均有一个从病情相对平稳的慢性期向病情恶化的加速期和急变期发展的过程。但是,CML发生转化的分子机制目前尚不清楚。

　　研究表明,许多肿瘤的发生和发展与微卫星DNAs的遗传不稳定性即基因组微卫星的不稳定性(MSI)和染色体等位基因微卫星序列的杂合性缺失(LOH)有关^［1］。为探索微卫星DNAs的遗传不稳定性与CML的病程发展间的关系,我们选择位于染色体17p11的Mfd41和位于18q21的DCC 两个微卫星序列,用PCR-银染法分析17例CML患者从慢性期向加速期和急变期发展过程中这两个微卫星的变化情况。

病例和方法

　　1　病例　经中国医学科学院血液病医院确诊的17例CML患者中男11例,女6例。年龄17～68岁,中位年龄42岁。从慢性期到加速期或急变期的间隔时间为8～175个月,中位间隔时间55个月。患者的临床资料见附表。

　　2　DNA的提取

　　2.1　患者慢性期标本采用从骨髓涂片提取DNA:将骨髓涂片上的细胞刮入0.5ml Ep管,用200μl细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl,2% SDS,1mg/ml蛋白酶K，pH 8.0)50℃裂解2小时,等体积酚-氯仿抽提后乙醇沉淀过夜。

　　2.2　加速期和急变期标本采用酚抽提法从患者骨髓穿刺样品中提取DNA:用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,加入2ml细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,150mmol/L NaCl,1%SDS,50μg/ml RNaseA，pH 8.0)37℃孵育1小时,然后加入蛋白酶K 100μg/ml,50℃反应3小时,等体积酚-氯仿抽提后乙醇沉淀过夜。

　　3　逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR）检测bcr/abl融合基因　按照本实验室常规方法^［2］,用RT-PCR法检测17例CML的bcr/abl融合基因。

　　4　引物的合成　2个微卫星序列的引物参照文献［3］,由中国科学院细胞生物研究所合成。

　　DCC: ①5′GATGACATTTTCCCTCTAGA 3′

　　②5′TTTAGTGGTTATTGCCTTGAA 3′

　　Mfd41:①5′CAGGTTCTGTCATAGGACTA 3′

　　②5′TTCTGGAAACCTACTCCTGA 3′

　　5　PCR试验

　　5.1　PCR：50μl体系中含MgCl₂ 2.0mmol/L,4×dNTPs各200μmol/L,引物各30pmol,模板DNA 1μg,Taq酶2.0U。94℃变性5分钟以后,按照94℃40秒,55℃ 40秒,72℃ 40秒,反应35个循环,最后72℃延伸10分钟。

　　5.2　电泳：取30μl PCR产物,用8%聚丙烯酰胺(PAGE),1×TBE缓冲液,250V电泳6个小时。

　　5.3　银染：取下凝胶,10%冰乙酸(HAC)固定20分钟后,水洗2次,每次3分钟,然后用0.1%AgNO₃(每100ml含150μl甲醛)染色,光照20分钟,水洗2次,每次20秒钟；3% Na₂CO₃(每100ml含Na₂S₂O₃ 0.2mg,甲醛150μl)显色10分钟,水洗后用1.5%EDTA 终止反应5分钟。照相保存结果。

　　6　结果判断　将同一患者慢性期与加速和(或)急变期标本的PCR扩增产物同时上样电泳,加速和(或)急变期的PCR扩增产物的电泳条带与慢性期的相比较,若出现某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上者,计为LOH;若出现等位基因条带增加或位置发生改变,计为MSI^［3］。阳性病例均经2次以上PCR扩增证实。

　　7　对照　采用从正常人外周血单个核细胞中提取的DNA作为方法对照,以去离子水代替基因组DNA作为空白对照。

结　　果

　　1　bcr/abl融合基因的检测　用RT-PCR对染色体t(9;22)易位所形成的bcr/abl融合基因进行检测,17例加速或急变期CML患者均为阳性,其中融合型为b2a2的10例,b3a2的7例(见附表)。

附表　17例CML患者的临床资料和实验室检测结果

　　2　基因组DNAs DCC和Mfd41微卫星遗传不稳定性

　　2.1　PCR-银染结果显示17例CML加速或急变患者的骨髓标本与其慢性期相比较,8例患者出现DCC和Mfd41微卫星改变,占47.5%。其中3例为加速期,5例为急变期,急变期微卫星改变的频率高于加速期(附表)。

　　2.2　6例出现DCC微卫星改变,其中2例(例4和6)出现在加速期,均为MSI(图1);4例出现在急变期,1例(例17)为MSI,2例(例10和16)为LOH,1例(例11)同时出现MSI和LOH(图2)。

　　图1　2例加速期患者DCC微卫星改变PCR-银染结果

　　2.3　2例出现Mfd41微卫星改变,1例(例3)在加速期，为LOH;另1例(例15)出现在急变期，为MSI(图3)。

　　图2　4例急变期患者DCC微卫星改变PCR-银染结果

　　图3　2例患者Mfd41微卫星改变PCR-银染结果

讨　　论

　　微卫星DNAs是1～6个核苷酸的重复序列,广泛分布于人类基因组中。目前,已从人类基因组连锁图谱分析中分离出数千个微卫星多态性标记,其中包括814个多态性位点。微卫星重复序列结构的改变可激活特定的原癌基因或使抑癌基因失活,导致癌变的发生和发展。由DNA复制或修复错误所导致的微卫星遗传改变已经在遗传性非息肉型结肠癌(HNPCC)及多种相关肿瘤中得到证实^［6］,但在恶性血液病中的研究较少。最近,Wada等^［3］首次报道在CML加速或急变过程中出现微卫星的遗传改变。然而,Silly等^［7］发现除了个别病例有LOH以外,在CML加速和急变过程中未见MSI。另外,汪林等^［8］报道9号染色体abl基因的D9S66微卫星有较高的LOH发生率。

　　DCC位于18q21，由于多数大肠癌均缺失1个DCC等位基因或DCC基因的表达显著减少，因此称DCC为大肠癌缺失基因。DCC编码1个细胞表面糖蛋白,与神经细胞粘附分子家族成员同源。DCC产物改变可减弱CML细胞与基质的粘附，阻止造血细胞之间的相互作用。我们扩增的是DCC基因第16外显子下游内含子的微卫星重复序列,在结肠癌中经常可检测到该区域的改变，提示该区域微卫星的变化可能造成DCC基因产物的改变。我们在17例加速或急变期CML中检出6例DCC微卫星扩增带型与其慢性期相比较发生了改变，提示DCC微卫星序列结构的改变与某些CML患者的加速或急变有一定的关系,而且MSI和LOH两种机制可能并存。

　　Mfd41位于17p12-11.1,与p53抑癌基因相邻,二者有相关性,在恶性疾病中易受累。我们在17例加速或急变期CML中检出2例Mfd41微卫星的扩增带型发生改变,表明Mfd41与CML的发展可能有一定关系,并提示Mfd41的序列改变有可能导致p53抑癌基因的失活。

　　值得注意的是,本组例6骨髓象仍处于慢性期,但其骨髓细胞的DCC微卫星扩增带型已经发生了MSI，提示该患者可能已进入加速期。随后病情的发展证实了我们的预测。本组17例患者在加速期和急变期发生MSI及LOH者与无MSI及LOH改变的患者相比较，前者已死亡4例，而后者仅有2例发生急变,无一例死亡。由此得出初步印象：出现微卫星遗传改变的CML加速或急变患者的预后可能较差。分析微卫星遗传不稳定性可能有助于对CML加速或急变的预测。

　　本课题受国家自然科学基金(39570322)资助

参 考 文 献

　　1　Nowal R. Mining treasures from ‘Junk DNA'. Science, 1994,263:608-610.

　　2　李戈,宋玉华,马小彤,等.不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究. 实验血液学杂志,1996,4:290-293.

　　3　Wada C, Shionoya S,Fujino Y, et al. Genemic instability of microsatellite repeats and its association with the evolution of chronic myelogenous leukemia. Blood, 1994,83:3449-3456.

　　4　Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Leukemia， 1996,10:751-756.

　　5　Ohyashiki K,Ohyashiki JH,Iwama H,et al. Telomerase activity and cytogenetic changes in chronic myeloid leukemia with disease progression. Leukemia, 1997,11:190-194.

　　6　Thibodeau SN, Schaid BD. Microsatellite instability in cancer of proximal colon. Science, 1993,260:816-819.

　　7　Silly H,Chase A,Mills KI, et al. No evidence for microsatellite instability or consistent loss of heterozygosity at selected loci in chronic myeloid leukemia blast crisis. Leukemia, 1994,8:1923-1928.

　　8　汪林,陈珊珊,苏风云,等.慢性粒细胞白血病同bcr-abl基因相关的频繁杂合性丢失. 实验血液学杂志,1996,4:278-284.

(收稿：1997-05-12　　修回：1997-11-28)

(校对：王叶青)