比较基因组杂交技术在检测急性淋巴细胞白血病高二倍体中的意义

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：曹琪　吴钦武　苏欣莹　牛超　何凯莉　陈竺　陈赛娟

单位：200025　上海第二医科大学附属瑞金医院、上海血液学研究所(曹琪、苏欣莹、牛超、何凯莉、陈竺、陈赛娟)；江西上饶县人民医院(吴钦武)

　　关键词： 高二倍体；白血病，淋巴细胞性，急性；比较基因组杂交；染色体R带

　　摘要　目的:评价比较基因组杂交(CGH)技术在白血病研究中应用的价值。方法：应用CGH技术检测高二倍体急性淋巴细胞白血病(ALL)患者14例，并与核型分析结果相比较。结果和结论：发现在高二倍体ALL中，部分和(或)整条染色体的增加比减少常见，两者相差7倍，其中21号和X染色体的增加最为常见。CGH与常规R带的分析结果比较可分为三种：①CGH和常规核型分析结果完全一致的有3例；②CGH分析和R带分析从不同角度提供了相对一致信息的有8例；③CGH分析和R带分析结果不一致的有3例，其中2例分别为约三倍体和约四倍体，另1例为正常/＋22嵌合型。

　　Application of comparative genomic hybridization to hyperdiploid acute lymphoblastic leukemia　Cao Qi，Wu Qinwu, Su Xinying, et al. Institute of Hematology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai　200025

　　Abstract　Objective: To evaluate the implication of comparative genomic hybridization (CGH) in leukemia study. Methods: Genomic abnormalities in 14 ALL patients were assayed by CGH, and the results were compared with those of conventional karyotype analysis. Results and Conclusion: Regional and/or whole chromosome over-representation was found to be more frequent than under-representation (43 gains versus 6 losses), the most common gains involved being chromosomes 21 and X. Comparison between the results of CGH and conventional R-banding analysis showed that: ①In 2 cases with trisomy, both the methods gave identical results.②In 8 cases, both the results were consistent excepting for minor discrepancies. ③In 3 cases, including 2 each with triploidy and tetraploidy respectively, and one with chimeric karyotype of normal/+22, the results from the two methods were discrepant.

　　Key words　Hyperdiploid　　Leukemia, lymphoblastic, acute　　Comparative genomic hybridization　　Chromosome R-banding

　　比较基因组杂交(CGH)是由Kallioniemi等^［1］在1992年首先提出的一种基于荧光原位杂交(FISH)的技术，它是一种可用于检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具。虽然CGH分析不能提供有关染色体易位或克隆异质性方面的精确信息，但它的优势在于不需要肿瘤组织培养或核型分析。我们用CGH分析了14例经细胞遗传学检测证实有染色体数量异常或大片段染色体区域异常的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者DNA的变化，并且报道了用这两种技术进行比较研究的结果。

材料和方法

　　1　标本　用酚/氯仿抽提了14例ALL患者和正常者的高分子量DNA。ALL患者14例中，儿童患者(4～13岁，中位年龄8岁)13例，成人男性患者(40岁)1例。

　　2　细胞遗传学分析　用24小时未经刺激的骨髓细胞培养和RHG显带技术，根据ISCN的标准(1991)进行核型分析。

　　3　中期分裂相细胞制备　正常的分裂相细胞由1名正常男性志愿者外周血淋巴细胞加植物血凝素(PHA)刺激后经72小时培养获得。用秋水仙素终止于分裂中期相并用低渗KCl溶液处理，用甲醇∶冰醋酸为3∶1的溶液固定，最后滴片。滴片在室温放置几天后用RNase(100μg/ml，pH7.0)37℃下处理1小时，然后用蛋白酶K(0.1μg/ml, pH7.0)室温消化5分钟。用乙醇脱水并吹干后，－20℃保存。

　　4　CGH　操作步骤根据Kallioniemi等的方法^［1］，14例患者分别进行过两次检测。肿瘤和对照DNA分别用不同颜色的荧光素标记，同时与正常的中期分裂相染色体杂交。利用肿瘤和正常DNA杂交信号的荧光强度的比例来反映肿瘤DNA情况。

　　用缺口平移系统和生物素-16-dUTP标记对照DNA。基因组DNA用适当浓度的DNase消化，使长度为300～2?000bp，并用DNA聚合酶Ⅰ增加标记效率。标记后的肿瘤和对照DNA各取800ng，与50倍的未标记Cot-1 DNA(Gibco公司)混合，并用乙醇沉淀。获得的DNA用12μl的杂交液(含50％甲酰胺、10％右旋糖酐和2×SSC，pH7.0)重新溶解。溶解后的混合探针75℃变性5分钟，37℃退火1小时。预处理后的分裂相滴片在70％甲酰胺/2×SSC(pH7.0)中70℃变性2分钟，在冰乙醇系列溶液中脱水后吹干。湿盒中37℃杂交2～3天。

　　杂交后先用50％甲酰胺/2×SSC(pH7.0)和0.1×SSC(pH7.0)42℃下各洗2次。按以下步骤进行显色：用卵清蛋白-荧光素异硫氰酸酯(FITC)(5μg/ml, Sigma公司)检测生物素标记的探针，接着用生物素-卵清蛋白(Sigma公司)和卵清蛋白-FITC扩增。地高辛标记的DNA依次与小鼠抗地高辛抗体(1∶200稀释，Sigma公司)，兔抗鼠IgG异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)(1∶200稀释，Sigma公司)和羊抗兔IgG TRITC(1∶200稀释，Sigma公司)孵育后显色。最后用含4μg/ml DAPI的抗荧光淬灭剂复染。

　　5　数字图像摄取和CGH分析　应用Cytovision (Applied Imaging公司，英国)CGH软件分析杂交后分裂相上的荧光比例，并显示数字图像。选择5～10个分裂相计算每条染色体绿、红荧光比例，染色体增加和减少的阈值分别选定1.25和0.75。这些数值是根据二倍体肿瘤细胞群中50％待测细胞中特定染色体三倍体(1.25)或单倍体(0.75)而设定的。当比例超过1.5或肉眼看到有信号增加时认为存在高水平的扩增。每一次CGH实验均设阳性和阴性对照。阴性对照是两种不同荧光标记的正常DNA共同杂交；阳性对照用一个已知的8号三体的标本。异染色质部分(1，9染色体的着丝点，近端着丝粒的短臂和Yq21)应在CGH分析中除去，因为在这些区域Cot-1 DNA影响杂交。由于在这项实验中用的对照DNA是3名男性供者的混合池，所以CGH实验并非都是性别匹配的。在性别不匹配的实验中分析X染色体时要考虑性别因素。

结果

　　1　细胞遗传学分析　用R带分析的ALL患者14例中3例有单条染色体(分别为＋6，＋8，＋22)增加；7例为多条染色体增加，其中部分患者染色体的增加在所分析的大部分分裂相中显示，但另一些患者，不同分裂相中染色体数量不一，造成克隆的不均一性；1例患者有约三倍体的核型；1例有约四倍体；尚有2例患者染色体异常呈大片段改变，包括1例同时有t(4;11)(q21;q23)和der(14p)的患者和另1例有dic(7;9)(p11;p11)和7，9短臂缺失的患者。所有患者的核型见附表。

　　2　CGH分析　14例ALL患者中12例患者经CGH分析有遗传不平衡，另2例CGH未能显示基因组异常。部分和(或)整条染色体的增加明显较减少为多，总计52份增加，6份缺失。有意义的是染色体的增加并非随机，而较集中涉及染色体4，6，8，10，14，17p，17q, 18，21和X。最常见的增加是第21号(占58%)和X(占58%)染色体。值得注意的是有2例(例3，4)均有21和X染色体的扩增。

　　3　CGH和R带结果比较　CGH和细胞遗传学检测结果的比较见附表。结果可分为3种不同的类型：①CGH和核型分析结果完全一致(例1，7，10)，CGH和R带都分别显示了8号三体和6号三体，在例10细胞遗传学和CGH分析都显示有多条染色体的增加(第8，10，18，21和X染色体)；②CGH和核型提示了相对一致的信息(例3，4，5，9，11～13)，超过50条染色体的高二倍体患者中，几乎所有CGH发现的染色体增加均在核型中有反映，但有一小部分在核型中显示的恒定的染色体增加在CGH资料中没有反映出来，如例13，这种差异很可能是因为标本中存在着克隆的异质性，特别值得注意的是例11，CGH可以检测到1q22～q31区域的增加，这与R带显示的结构异常add(1)(q22～31)极其吻合，在另2例有染色体结构异常的标本中也得到了一致的信息，例14的R带分析显示45，XX，dic(7；9)(p11,p11)，而CGH检测到了7p和9p的缺失(见附图)，例12的带型分析除了t(4；11)平衡易位外(CGH技术不能检测到)，还有der(14p)，而CGH显示Y染色体的增加；③CGH和核型不一致，以常规的细胞遗传学检测提示例8为三倍体，例2为四倍体，而CGH检测到例2存在17q增加和9p、16q和17p的缺失，但不能将二倍体与三倍体或四倍体加以区别，例6带型分析显示了部分分裂相细胞中有22号染色体三体呈嵌合体状态，而CGH结果未能显示。

附表　14例患者CGH和细胞遗传学分析的比较

　　A：完全一致；B：大体一致，但有少量差异；C：明显差异；4n:4倍体；3n：3倍体；add:+；cp：复合核型

讨论

　　在过去的几年中，CGH已被广泛用于实体瘤发病机制的研究^［2～4］，在实体瘤中常有肿瘤基因的扩增和抑癌基因的缺失，CGH为检测这些基因的变化提供了线索。为了评价CGH在白血病中应用的价值^［5，6］，我们选择了一组有染色体数量异常的ALL患者进行研究，并比较了CGH和常规细胞遗传学分析的结果。其优点：①ALL的核型常因培养失败或分裂相形态较差而使分析发生困难，而CGH分析不须经过培养；②染色体数量异常，尤其是高二倍体是ALL细胞遗传学的主要特征，与ALL预后直接相关，CGH的优势在于它在一个简单的杂交中显示了肿瘤标本DNA拷贝数变化(减少、缺失、增加、扩增)的一个概况。

a为R显带后部分核型显示dic(7;9)(p11;p11); b为同一患者的CGH结果显示7p和9p缺失。11个分裂相中7号和9号染色体平均比例用中线表示，两侧线条表示在95％的可信范围之内

附图　例14的标本核型和CGH结果的比较

　　我们的结果显示，当单一数量染色体的异常发生时，如三体，CGH和核型分析的结果完全一致。在伴高二倍体的ALL患者中，绝大多数的恒定的染色体增加CGH都能检测到，非随机的染色体增加主要为4，6，8，10，14，17，18，21和X，最常见的染色体扩增是21(包括21四体)和X(包括X四体)。这一结果与以前用其它方法得到的结论一致^［7］。它们的生物学意义还需要进一步研究。

　　除了染色体数量的改变，在某些染色体结构异常的分析中，CGH亦能体现在分析基因组不平衡时的价值。例如，虽然CGH 不能检测到例12的t(4；11)，但它提示了Y染色体的增加，这是在R带分析中没有发现的。一个更好的例子是例14中的dic(7；9)(p11；p11)，虽然CGH不能检测到染色体易位，但证实了7号和9号染色体短臂的缺失，这与细胞遗传学分析的结果一致。

　　在某些情况中，CGH和常规细胞遗传学分析可能不一致。例如，CGH不能检测到三倍体或四倍体，而在细胞遗传学分析中很容易发现(如例2，8)。此外，克隆的异质性不易被CGH检出，如例6中的22三体，因为CGH只能检测到被检细胞的平均值，而很少一部分细胞的染色体异常不能影响肿瘤DNA和对照DNA之间的荧光强度比值。

　　我们的研究表明CGH是一种快速、简单和有效的用于检测ALL中大片段染色体区域或染色体数量改变的方法。尤其适用于染色体培养失败及形态差的情况。然而，CGH的应用范围有其局限性，只有与常规细胞遗传学分析、FISH和其它分子生物学工具相结合，才能全面地阐明基因组异常。

　　本课题受国家自然科学基金(39770830)及英国Lady Tata Memorial Trust基金资助

参 考 文 献

　　1　Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sndar D, et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumours. Science, 1992, 258:818-821.

　　2　Cher ML, Donal MG, Bookstein R, et al. Comparative genomic hybridization, allelic imbalance, and fluorescence in situ hybridization on chromosome 8 in prostate cancer. Genes Chrom Cancer, 1994, 11:153-162.

　　3　Kallioniemi OP,Kallioniemi A, Piper J, et al. Optimizing comparative genomic hybridization for the analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumors. Genes Chrom Cancer, 1994, 10:231-243.

　　4　Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Citro G, et al. Identification of gains and losses of DNA sequences in primary bladder cancer by comparative genomic hybridization. Genes Chrom Cancer, 1995, 12:213-219.

　　5　Bentz M, Dohner H, Huch K,et al. Comparative genomic hybridization in the investigation of myeloid leukemia. Genes Chrom Cancer, 1995, 12:193-200.

　　6　Bentz M, Huck K, du Manoir S, et al. Comparative genomic hybridization in chronic B-cell leukemias shows a high incidence of chromosomal gains and losses. Blood,1995, 85:3610-3618.

　　7　Heim S， Milelman F. Cancer cytogenetic chromosomal and molecular genetics aberrations of tumor and cells. 2nd ed. New York: Wiley, 1995. 180-236.

(收稿：1997-06-18　　修回：1997-12-02)

(校对：张志方)