小鼠T淋巴细胞白血病细胞系(L615)B7瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究
中华血液学杂志 1998年第5期第19卷 论 著
作者：李牧 尤胜国 廖晓龙 魏代奎
关键词： 基因，B7-1；瘤苗；肿瘤免疫
摘要 目的：探讨高度恶性的小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615转导B7-1基因后激发移植宿主体内的抗肿瘤免疫情况。方法：以逆转录病毒为载体，将B7-1基因导入小鼠白血病细胞系L615中，获得高表达B7-1分子的L615-B7细胞，作为肿瘤疫苗进行体内移植，观察其免疫保护作用并检测瘤苗体外激活的T细胞杀伤活性、细胞增殖和因子分泌情况。结果：体内移植实验表明B7-1分子的表达可降低L615细胞在小鼠中的致瘤性，明显延长其生存时间。用B7瘤苗预先免疫小鼠，对随后的瘤细胞攻击有明显的免疫保护作用。B7瘤苗体外活化的T细胞对同种细胞有特异性杀伤活性，并可刺激L615-B7的增殖。结论：B7-1基因的导入并有效表达可增强肿瘤细胞免疫原性，激活T细胞，提高宿主抗瘤免疫。
Experimental study of anti-tumor immunity induced by B7 vaccine of a highly malignant murine leukemic T cell line(L615) Li Mu,You Shengguo,Liao Xiaolong, et al. State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology,CAMS and PUMC, Tianjin 300020
Abstract Objective: To assess the potential of B7-1 vaccine in inducing immunity to leukemic cells.Methods: B7-1 gene was introduced into L615 cells and then the positive clone (L615-B7) highly expressing B7-1 was selected. Tumorigenic and immunoprotective activities of L615-B7 cells were studied in vivo. T cell functions of cytotoxicity , proliferation and growth factor secretion were detected in vitro.Results: Syngeneic 615 mice receiving L615-B7 cells survived longer than control. After being immunized with L615-B7,the mice gained remarkable immuno-protection against the following challenge of wild-type L615 cells, and in some mice could survive over a long duration. In vitro, the B7-activated effector cells exhibited a specific cytotoxicity to L615 and L615-B7 cells,and an enhanced proliferation in response to L615-B7. Conclusion:B7 vaccine could improve the immunogenicity of tumor cells , activate T cells and enhance in vivo the anti-tumor immunity.
Key words Gene,B7-1 Tumor vaccine Tumor immunity
B7基因表达产物是CD28和CTLA-4的一种配基，并为T细胞的激活提供共刺激信号，在激发抗肿瘤免疫中起着重要的作用。肿瘤细胞即使表达正常水平的MHC-Ⅰ类抗原并存在特异性的肿瘤肽，在缺乏适宜的共刺激信号时，也能逃脱宿主免疫系统的控制［1］。因此，通过基因转染的方法使肿瘤细胞表达B7分子，激活机体的抗瘤免疫能力，从而控制肿瘤的生长，是肿瘤免疫基因治疗中一个颇有前途的尝试。我们将小鼠B7基因家族［2］中的一个重要成员B7-1导入小鼠T淋巴细胞白血病细胞系L615中，进行体内、外实验，观察其对L615细胞在同系小鼠中的致瘤性及其免疫原性。
材料和方法
1 实验动物和细胞株 纯系615小鼠，6～8周龄，雌雄不限，由本所动物室提供。Balb/C裸鼠(nu/nu)，雄性，体重18～20g，购自卫生部药物和生物制品检定所动物中心。L615和L7811细胞系均为表型L3T4+T淋巴细胞白血病细胞系，由本所建立，体外传代培养。PA317，NIH3T3，L929，CTLL细胞系为本室常规传代培养。
2 主要试剂 含B7-1基因的逆转录病毒质粒pLXSN B7-1及空质粒pLXSN，由美国西雅图陈列平博士惠赠［3］ 。参照文献［4］，用DNA合成仪合成一对B7-1基因引物。大鼠抗小鼠B7-1/CD80单克隆抗体(单抗)由陈列平博士惠赠。大鼠抗小鼠Thy1.2，Lyt-2，L3T4单抗及兔抗大鼠IgG-FITC购自北京医科大学免疫室。M-MLV反转录试剂盒、G418、MTT为Gibco BRL产品。CytoTox96非放射性细胞毒测定盒为Promega产品。
3 质粒转化肿瘤细胞 分别将pLXSN B7-1及pLXSN质粒转化大肠杆菌DH5α中，获得大量扩增质粒。以电穿孔法(电压0.76kV，电容25μF)导入PA317细胞中，用G418(800μg/ml)筛选阳性克隆。以3T3细胞测定病毒上清滴度(104cfu/ml)，进一步感染L615细胞，G418筛选阳性转化细胞(L615-B7和L615-Neo)。
4 表达B7分子的转化细胞的鉴定 按常规聚合酶链反应(PCR)，逆转录(RT)-PCR方法，扩增L615-B7和L615-Neo细胞DNA和总RNA中B7-1片段，电泳鉴定。按常规间接免疫荧光法，用大鼠抗小鼠B7-1/CD80单抗染色，荧光镜检和FACS测定。
5 PI-FCM法检测L615和L615-B7细胞周期。
6 动物实验 裸鼠及同系小鼠致瘤性实验 将1×106 L615、L615-Neo和L615-B7细胞经腹腔给Bal b/C裸鼠注射，每组3只，观察其存活时间。将以上3种细胞，按不同数量级接种同系615小鼠腹腔，每组5只，观察存活时间。瘤苗免疫预防保护实验：分别将2×104100Gy照射灭活的L615、L615-B7和未经灭活的L615-B7瘤苗预先免疫615小鼠(皮下注射)，20天后用2×103和2×104活L615瘤细胞攻击，以未经免疫的小鼠为对照，比较不同的预免疫对随后瘤细胞攻击的免疫保护能力。
7 B7瘤苗体外活化的效应T细胞(Ec-B7)的获得 方法参照文献［5］并有所改动。取经照射灭活的L615细胞(1×107)免疫(10～14天)的615小鼠脾细胞和100Gy灭活的L615-B7细胞按10∶1比例混合培养，在含50U/ml IL-2的完全培养基中2～3天半量换液，10天后用100Gy灭活的L615-B7细胞再次刺激，如此三轮后，得到Ec-B7细胞。
8 MTT法测T细胞增殖活性 Ec-B7细胞作为效应细胞(Ec)，100Gy灭活的L615-B7作刺激细胞(Sc)，30Gy照射的小鼠脾细胞作为抗原提呈细胞(APC)，按1×106/孔，4×105/孔，1×107/孔混合培养96小时，按常规MTT法检测吸光度(A，曾称光密度OD)值。
增殖活性(%)=(实验组A值-对照组A值)/(实验组A值)×100%
实验组：Ec+Sc+APC;对照组：Sc+APC。
9 LDH释放法测细胞毒活性 Ec-B7为效应细胞，L615、L615-B7和L7811细胞分别为靶细胞，按效∶靶=20∶1，10∶1，5∶1比例混合培养20小时，按CytoTox 96试剂盒提供方法于492nm波长下检测。
细胞毒活性(%)=
(实验组A-效应细胞自然释放组A-靶细胞自然释放组A)/(靶细胞最大释放组A-靶细胞自然释放组A)
×100%
10 细胞因子分泌检测 以Ec-B7为效应细胞，100Gy灭活L615、L615-B7和L7811细胞作刺激细胞，20∶1混合培养，取24小时和72小时上清分别用CTLL和L929细胞系检测IL-2和TNF-α分泌。
结果
1 L615-B7细胞中B7-1表达的鉴定 比较L615-B7及L615-Neo细胞B7-1基因PCR扩增结果， L615-B7细胞有310bp扩增带，而L615-Neo为阴性。表明B7-1已转入L615细胞基因组中，并在RNA水平稳定表达。经流式细胞仪检测间接免疫荧光结果，以只加荧光二抗组为阴性对照，L615-Neo组B7-1表达为阴性，L615-B7组B7-1表达阳性率为97.5%。
2 肿瘤细胞L615-B7体外生物学特性 L615-B7细胞比野生型L615细胞增殖速度略有降低，PI-FCM细胞周期检测，其S期细胞占22.1%，而野生型为30.0%，且在液体培养基中有部分成团生长的趋势。
3 B7瘤苗诱导的体内生物学反应
3.1 裸鼠致瘤性实验 在T细胞缺陷的Balb/C裸鼠中，L615-B7具有与野生型细胞同样的致瘤性，接种第9天小鼠全部死亡。
3.2 同系小鼠中的致瘤性实验 L615-B7细胞能明显延长L615小鼠存活时间(见表1)。
3.3 瘤苗免疫预防保护实验 由表2可见，用不同预处理的细胞免疫小鼠，20天后用瘤细胞攻击，经L615-B7瘤苗免疫过的小鼠对瘤细胞的攻击有明显的免疫保护作用，若用103瘤细胞攻击，小鼠可长期存活。另外，灭活的L615细胞和灭活的L615-B7所诱导的免疫保护能力明显低于活的B7瘤苗的作用。
表2 B7瘤苗预防免疫后用瘤细胞攻击的小鼠存活时间(天，
±s)
| 预免疫细胞 |
攻击的L615活瘤细胞数 |
| 2×104 |
2×103 |
| 未经免疫的对照组 |
8.0±0# |
13.0±2.1 |
| 灭活的L615细胞 |
14.4±0.5△ |
|
| 灭活的L615-B7细胞 |
19.8±3.1** |
|
| 活L615-B7瘤苗 |
27.6±2.1* |
＞30 |
免疫细胞数均为2×104，免疫后第20天用L615
活瘤细胞攻击；*与#、△、**相比，P＜0.01
4 Ec-B7的生物学特性
4.1 Ec-B7的免疫表型 用间接免疫荧光法染色后镜检发现，绝大多数(＞95%)Ec-B7为Thy1.2(+)，其中CD8+(lyt2+)细胞占优势，为67%，CD4+(L3T4+)细胞占17%。
4.2 Ec-B7的细胞毒活性 体外活化的Ec-B7对同种细胞L615及L615-B7有明显的特异性杀伤活性，且对L615-B7的杀伤活性更强(见表3)。L7811细胞为与L615细胞同源，但细胞特异抗原不同的异种细胞，Ec-B7对其杀伤活性较弱。
4.3 Ec-B7的增殖活性 MTT细胞增殖试验结果表明，Ec-B7对L615-B7有一定的刺激生长效应，增殖活性为43.6%；而对L615及L7811细胞刺激作用很低，增殖活性分别为17.8%和14.4%。
4.4 Ec-B7细胞分泌因子的能力 分别以L615-B7、L615和L7811作刺激细胞，混合培养上清中尤以L615-B7作刺激细胞组的TNF-α和IL-2分泌明显，其它组与培养液对照组相比不明显或更弱。
表1 接种不同细胞后615小鼠的存活时间(天，±s)
| 接种细胞 |
接种细胞数 |
| 2×106 |
2×105 |
2×104 |
2×103 |
| L615 |
6.4±0.5 |
7.0±1.0 |
8.0±0 |
13.0±2.1 |
| L615-Neo |
6.8±0.4 |
7.0±1.0 |
9.4±0.5 |
12.4±0.5 |
| L615-B7 |
18.4±0.5* |
24.4±0.5* |
＞30△ |
＞30△ |
注：每组鼠数均为5只； *与L615组和L615-Neo组相比,P＜0.01；△仍健康活存的小鼠于接种第30天被处死
表3 Ec-B7对靶细胞的杀伤活性(%)
| 靶细胞 |
效∶靶 |
| 20∶1 |
10∶1 |
5∶1 |
| L615-B7 |
97.0 |
77.0 |
32.0 |
| L615 |
67.1 |
44.2 |
23.5 |
| L7811 |
22.4 |
8.1 |
2.7 |
讨 论
目前研究表明，在小鼠许多肿瘤(包括黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤等实体瘤)以及最近报道的髓系白血病中，B7瘤苗均有增强免疫原性，诱导T细胞免疫的效果，但尚未见有人在小鼠T淋巴细胞白血病中做过尝试。我们应用的模型是一株高度恶性的纯系615小鼠T淋巴细胞白血病细胞系(L615)，已证实它具有特异性肿瘤移植排斥抗原［6］，正常表达MHC-Ⅰ抗原，但不表达B7-1。将B7-1基因导入L615细胞，筛选稳定高表达克隆作为瘤苗，已被证实是诱导移植宿主抗瘤免疫的有效手段。
L615细胞是一株高度恶性的白血病细胞系，接种后小鼠7～8天就全部死亡，表现为脾脏明显肿大，外周血90%以上为瘤细胞。由于接种鼠存活时间太短，恶性变化迅速，给实验观察带来一定困难。我们曾尝试，以B7瘤苗治疗荷瘤小鼠，但未观察到治疗效果，原因可能是在机体短暂的急性恶变过程中，B7瘤苗尚来不及调动宿主的抗瘤免疫。尽管如此，从我们实验的致瘤性及免疫保护性结果可看出，经B7瘤苗处理的小鼠其存活时间明显长于对照组，具有统计学意义，虽大部分接种鼠最终发病，但其寿命显著延长的效果可以证明B7瘤苗对诱导机体免疫是很有效的。
从结果可以看出，L615-B7同其它转化细胞一样具有增殖能力降低的特点，另从其聚集生长的趋势推测，B7-1的表达可能上调细胞某些粘附因子的分泌。
分别用有活力的B7瘤苗和照射后无增殖能力的B7瘤苗免疫小鼠，对随后瘤细胞攻击的保护能力有显著性差异。从已报道的其它实验室的结果也看到类似现象，但尚未有明确的解释。我们分析有两种可能:①照射灭活的B7瘤苗在体内无扩增能力，一次性地短暂刺激机体的免疫细胞远不如活瘤苗持续性刺激所达到的免疫效果好；②机体的免疫细胞需识别完整的肿瘤抗原肽而被激活，而照射灭活的瘤苗可能大部分的肿瘤抗原不完整，不能高效率地被T细胞识别，所以其诱导免疫的能力很弱。
用瘤苗免疫小鼠，并不是瘤苗数量越大越好。过高的细胞数(如2×106)会使瘤苗对T细胞的活化能力不足以抵抗它本身的增殖能力，最终使小鼠发病而死。我们在实验中采用了较适中的量(2×104)，这样可使机体免疫系统达到动态平衡，使个体长期生存。
CD8+和CD4+T细胞是肿瘤细胞免疫溶解的关键。导入肿瘤细胞的B7分子可以直接介导不依赖于抗原提呈细胞的T细胞激活，所以，通常B7瘤苗诱导的免疫以CD8+T细胞为主，这与我们的结果是一致的。
参 考 文 献
1 Liu Y， Linsley PS. Costimulation of T-cell growth.Curr Opin Immunol,1992,4:265-270.
2 June CH, Bluestone JA, Nadler LM, et al. The B7 and CD28 receptor families. Immunol Today， 1994,15：321-331.
3 Chen LP, McGowan P, Ashe S, et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated tumor immunity. J Exp Med,1994,179:523-532.
4 Sanderson IR, Ouellette AJ, Carter EA, et al. Differential regulation of B7 mRNA in enterocytes and lymphoid cells. Immunology, 1993,79:434-438.
5 Matis LA, Ruscetti SK, Longo DL, et al. Distinct proliferative T cell clonotypes are generated in response to a murine retrovirus-induced syngeneic T cell leukemia: viral gp70 antigen-specific MT4+ clones and Lyt-2+ cytolytic clones which recognize a tumor-specific cell surface antigen. J Immunol, 1985,135:703-713.
6 尤胜国. 小鼠白血病L615肿瘤移植性抗原的研究. 中华肿瘤杂志,1988,7:189-193.
(收稿：1997-08-29 修回：1997-12-25)
(校对：徐丽娟)
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