急性非淋巴细胞白血病联合药敏试验的初步研究

中华血液学杂志 1998年第2期第19卷 论　　著

作者：罗梅华　卞寿庚　薛艳萍　冯敏　桂福民　王承志　赵耀中　杨纯正

　　关键词： 白血病；化学疗法；抗药性，多药

　　摘要　目的:为建立与联合化疗相适应的体外联合药敏试验。方法:用Chou's半效原则分析法摸索出HA、DA、AA、MA、HAD、HAA、HAM 7种化疗方案各药之间的最佳联合比例,按这种比例关系,用MTT法测定了79例急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者对该7种方案的体外敏感性。结果(体外/体内,S:敏感,R:耐药)：S/S 67例,R/R 9例,R/S 2例,S/R 1例。与临床总符合率96.2%;阳性符合率98.5%;阴性符合率81.8%;试验敏感性97.1%;特异性88.9%。结论:该研究探索的体外联合药敏试验与临床治疗敏感性有很好的相关性,试验敏感性与单药药敏试验相当,特异性优于单药药敏试验。

　　Study on combined chemosensitivity test in acute non-lymphocytic leukemia　Luo Meihua,Bian Shougeng,Xue Yanping,et al. 　Institute of Hematology,CAMS and PUMC,Tianjin　300020

　　Abstract　Objective:To explore the methods of combined chemosensitivity test in vitro.Methods:The chemosensitivity of leukemia cells to 7 kinds of combined chemotherapy regimens,including DA,HA,AA,MA,HAD,HAA and HAM,was estimated in 79 patients with ANLL by MTT assay in vitro.The ratios of drug combinations at which synergistic interactions between drugs are to the highest levels were determined by using Chou's “median effect analysis”.Results:There were 67 S(sensitive)/S,9 R(resistant)/R,2 R/S,1 S/R(in vitro/in vivo) in 79 patients.The general,positive and negative coincident rates of in vitro with in vivo,specificity and sensitivity were 96.2%,98.5%,81.8%,88.9% and 97.1%,respectively.Conclusion:This method is better than the single drug test,and it is more useful to find drug resistant patients.

　　Key words　Leukemia　　Chemotherapy　　Drug resistance,multiple

　　化疗药敏试验方法很多,不少报道证明体外药敏试验结果与临床疗效有较好的相关性,近年来的MTT法以其简单、快速、经济、客观等优点为大多数研究者所接受^［1］。但常用体外药敏试验预示的只是单个药物的体外敏感性,与临床联合化疗有相当大的差距,难以反映联合药物之间存在的协同、相加和拮抗作用^［2］。此外,单药药敏以联合化疗方案中一种(或一种以上)药物敏感即判为体外敏感,这种标准也不够客观。联合药敏试验能更直接、客观地确定临床所用联合方案的体外敏感性,预示临床联合化疗的疗效^［3］。我们用MTT法研究了几种临床常用联合化疗方案的体外药敏试验,测定了79例急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者对化疗药物的体外敏感性,并对体外药敏结果与临床敏感性的关系进行了分析。

材料和方法

　　1　病例　79例ANLL均为我院住院病例,年龄14～68岁(中位年龄37岁)。男56例,女23例。初治65例,复发14例。急性髓细胞白血病(AML)77例(M₁ 4例,M₂ 41例,M₃ 5例,M₄ 15例,M₅ 8例,M₆ 3例,M₇ 1例),急性杂合性白血病2例。5例M₃为用维甲酸未缓解后改用联合化疗的病例。

　　2　白血病细胞悬液的制备　具体方法见文献［4］。

　　3　药物的作用与细胞培养　联合药敏试验所筛选的化疗方案有：HHT(高三尖杉酯碱)+Ara-C(阿糖胞苷)(HA方案)；DNR(柔红霉素)+Ara-C(DA方案)；AMSA(安吖啶)+Ara-C(AA方案)；MTZ(米托蒽醌)+Ara-C(MA方案)；HHT+Ara-C+DNR(HAD方案)；HHT+Ara-C+AMSA(HAA方案)和HHT+Ara-C+MTZ(HAM方案)。具体操作方法见文献［4］。用Chou's半效原则分析法得出方案中各药物彼此协同作用最大时的比例(最佳联合比例)联合。Chou's半效原则分析法能评估按一定比例联合的药物之间的相互作用,得出各细胞杀伤水平的联合指数(CI)值,CI＜1表示联合药物之间有协同作用,CI值越小协同作用越大。不同比例联合协同作用大小用CI₅₀(50%杀伤水平的CI)值表示^［2］。将Chou's半效原则分析法的计算过程编成计算机程序，所有的CI值均用计算机处理得出。HA、DA、AA和MA方案中,Ara-C与HHT、DNR、AMSA、MTZ的联合比例分别为20∶1、10∶1、1∶2.5、5∶1;HAD、HAA和HAM方案中,HHT、Ara-C与DNR、AMSA和MTZ联合比例分别为1∶10∶1,1∶10∶20,1∶10∶2。测定16例ANLL患者各联合方案的剂量效应关系确定药物敏感范围,选择最佳药物浓度。

　　4　MTT测定　具体方法见文献［4］。

　　5　体内外敏感性的判断标准　根据16例ANLL患者的剂量效应关系确定体外敏感和耐药标准：①临床用标准剂量的上述7种联合方案之一诱导化疗,治疗≤2个疗程达完全缓解者为体内敏感；②治疗2个疗程不缓解,但在第1个疗程结束后外周血中白细胞计数最低时骨髓白血病细胞下降指数(MBDI＝化疗前与停化疗后外周血中白细胞计数最低时的骨髓白血病细胞百分数之差,除以化疗前骨髓白血病细胞百分数×100%)≥60%者为体内敏感,＜60%者为体内耐药^［4］。

　　6　体外药敏试验结果与体内敏感性关系的评定　体外试验显示敏感(S)的联合方案临床应用时亦显示敏感(体外/体内:S/S)为真阳性,而显示耐药(R)为假阳性(S/R)。反之,体外试验显示不敏感的联合方案临床应用时亦显示耐药为真阴性(R/R),而显示敏感为假阴性(R/S)。

结　　果

　　1　16例患者对HA、DA、AA、MA、HAD、HAA和HAM方案的剂量效应关系　7个方案分别以附表中药物浓度组合，则敏感组与耐药组白血病细胞存活率(SF)差异具有高度显著性(P＜0.01),敏感组≤30%,耐药组＞30%(附表)。因此上述药物浓度分别为该7种方案药敏试验的最佳药物浓度。

附表　联合药敏试验中最佳药物浓度的选择

　　根据16例患者剂量效应关系,敏感组SF≤30%; 耐药组SF＞30%，P＜0.01

　　2　79例ANLL患者体外药敏试验结果与体内敏感性的关系　体外敏感者68例,S/S 67例,S/R 1例;体外耐药11例,R/S 2例,R/R 9例。体外联合药敏试验结果与临床治疗结果的总符合率(S/S的例数与R/R的例数之和除以总例数×100%)96.2%;阳性符合率(S/S的例数除以S/S的例数与S/R的例数之和×100%)98.5%;阴性符合率(R/R的例数除以R/R的例数与R/S的例数之和×100%)81.8%;预示的敏感性(S/S的例数除以S/S的例数与R/S的例数之和×100%)97.1%;特异性(R/R的例数除以S/R例数与R/R的例数之和×100%)88.9%。

讨　　论

　　联合药物之间存在的相互作用因药物联合比及其与细胞作用的时间顺序的不同而不同,因此各药之间存在着浓度配比和时间顺序关系。曾有作者开展过急性淋巴细胞白血病联合药敏试验,针对长春新碱(VCR),模拟临床体内给药顺序,即在细胞中先加入VCR作用8小时后再按顺序加入其它药物,其浓度按临床实际用量推算出的最大血药浓度作为试验浓度^［5］。但由于不同药物的药代动力学不同,联合方案中各药实际血药浓度与按临床用量推算出的最大血药浓度相差很大,如根据药代动力学结果,临床治疗用去甲氧柔红霉素10mg/m²或DNR 50mg/m²时,两者的实际血药浓度相差无几^［6］,而按临床用量推算的DNR最大血药浓度竟是MTZ的10倍,可见用临床用药剂量推算出的最大血药浓度进行体外联合药敏试验并不很合理,该试验的结果也不理想。美国学者根据药代动力学结果,模拟联合化疗中各药物的体内血药浓度,测定了10例患者对5个联合方案的敏感性,并根据体外药敏试验结果选择敏感方案进行化疗,也未能收到理想的效果^［7］。联合化疗是利用联合药物之间的协同作用取得单药所不能达到的效果,因此要真正了解联合方案的敏感性,需了解联合药物配比与效应之间的关系,找出具最大协同作用的药物比,即联合药物的最佳配比进行体外敏感性测定，才能反映出联合方案的真正敏感性。Chou提出的半效原则分析法能分析出不同细胞杀伤水平联合药物之间的相互作用及其程度,我们用此法摸索出HA、DA、AA、MA、HAD、HAA和HAM方案中各药物间联合的最佳比例,并测定了79例ANLL患者对这些最佳比例联合化疗方案的体外敏感性。至于联合药物的时序性,除了药物作用机制的相互作用外,体内还有药代动力学的相互作用。有报道Vp16和Ara-C存在时序协同作用^［8］,但Ara-C与DNR、HHT、AMSA、MTZ等药物的程序协同作用不清楚,都有待进一步研究。但我们的研究结果显示体外联合药敏试验结果与临床有很好的相关性,总符合率达96.2%。

　　我们曾报道过单药药敏试验结果，其敏感性达97.1%,与联合药敏试验结果相当。这主要是因为：①单药药敏试验采用的药物浓度实际高出体内平均血药浓度的10倍甚至几十倍,使得体外敏感性高于体内;②在分析体外药敏试验结果与体内敏感性的关系时,单药药敏试验是以联合方案中一个或一个以上药物敏感判断为该联合方案体外敏感,实际上,含一个敏感药物的联合方案临床不一定真正敏感,这种判断标准使联合方案的体外敏感率高于体内实际敏感率。出现假阳性,使试验的特异性差。我们的结果也显示单药药敏试验的特异性(71.4%)明显低于联合药敏试验(88.9%)(P＜0.01)。文献报道也显示单药药敏敏感性高(92.1%),而特异性较差(69.1%)^［9］。目前临床联合化疗完全缓解率高达65%～85%,说明患者对大部分化疗方案是敏感的,那么药敏试验的目的是既要找出敏感药物,更要发现少数不敏感的患者和不敏感的方案,避免应用不敏感方案,选择敏感方案,以提高疗效,减少耐药。联合药敏试验敏感性高、特异性强,第5天能出结果,较单药药敏试验更有实用价值。

　　由于大多数药物的时序协同作用不清楚,我们的联合药敏试验只考虑了药物相互作用的一个方面,随着对联合药物之间作用机制和药代动力学的研究进展,建立更完善的体外联合药敏试验将成为可能。

参 考 文 献

　　1　Hoffman RM.In vitro assays for chemotherapy sensitivity.Critical Reviews Oncol/Hematol，1993,15:99-110.

　　2　Chou TC.Assessment of synergistic and antagonistic effect of chemotherapeutic agents in vitro.Contrib Gynecol Obstet,1994,19:91-126.

　　3　Kaspers GJL,Vveerman AJP,Pieters R,et al.Drug combination testing in acute lymphoblastic leukemia using the MTT assay.Leuk Res,1995,19:175-183.

　　4　罗梅华,卞寿庚,冯敏，等.药敏试验MTT法对急性白血病化疗疗效的预示价值.实验血液学杂志,1995,3:57-59.

　　5　张鲁榕,孔宪涛,谢映华,等.白血病化疗药物体外敏感试验的临床应用.中华血液学杂志,1990,11:141-142.

　　6　Ulf T,Britt S,Christer P.Comparison of the intracellular pharmacokinetics of daunorubicin and idarubicin in patients with acute leukemia.Leukemia,1994,18:158-165.

　　7　Perach L,Moneid K,Cormang B,et al.Combined chemosensitivity test in acute leukemia.Leuk Lymphoma,1994,11:583-589.

　　8　Gerhard E, Barbarb P, Thilo W, et al. Intracellular cytosine arabinoside accumulation and cytosine arabinoside triphosphate formation in leukemic blast cells is inhibited by etoposide and teniposide.Leukemia，1992,6:582-591.

　　9　von Hoff DD.In vitro predictive testing:the sulfonamide era.Int J Cell Cloning,1987,5:179-191.

(收稿：1997-03-26　　修回：1997-08-14)

(校对：王汝瑞)