逆转录-聚合酶链反应银染分析IRF-1基因在白血病中的表达

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论　　著

作者：夏放　袁有忠　章卫平　刘本俶　孟沛霖

单位：200433　上海，第二大军医大学长海医院血液科

　　关键词： 聚合酶链反应；银染分析；白血病；基因，IRF-1

　　摘要　目的：初步分析白血病细胞中IRF-1基因表达水平的变化。方法：采用逆转录-聚合酶链反应，银染分析检测24例白血病患者和3种白血病细胞系中IRF-1基因表达水平。结果：3例白血病患者未检测到IRF-1基因表达，5例患者及HL-60、HIMeg细胞系IRF-1基因表达明显降低。结论：部分白血病患者的发病机制可能与IRF-1基因表达缺失或下降有关；IRF-1基因表达水平的变化可能对部分白血病患者的疗效观察及预后有参考价值。

　　Study on expression of IRF-1 gene in human leukemia with RT-PCR and the silver sequence techniques.　　Xia Fang,Yuan Youzhong,Zhang Weiping,et al.Changhai Hospital,The Second Military Medical University,Shanghai 200433

　　Abstract　Objective：To explore preliminarily the changes of IRF-1 gene expression in leukemias.Methods：The expression of IRF-1 gene in 24 leukemia patients and 3 leukemic cell lines were studied with RT-PCR and the silver sequence techniques.Results：No expression of IRF-1 gene in 3 patients,and significantly decreased expressions in 5 patients and in HL-60 and HIMeg cell lines were revealed.Conclusion： The mechanism of human leukemogenesis may be partly associated with no or low-expression of IRF-1 gene.

　　Key words　Polymerase chain reaction　Silvr sequence　Leukemia　Gene,IRF-1

　　抑癌基因的失活和癌基因的激活可能与白血病的发生和演变有密切关系^［1］。IRF-1基因定位于5q31.1,其功能是激活I型干扰素和某些干扰素介导基因的转录活性,含10个外显子和9个内含子,第2，3，4外显子序列高度保守^［2］,近来研究证实IRF-1基因具有抑癌基因特性^［3，4］。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和银染技术,对20例白血病患者及3种细胞系、7例非恶性血液病患者、8例正常健康人的骨髓细胞中的IRF-1基因表达作了分析。初步结果报告如下。

材料和方法

　　1　骨髓细胞　根据FAB分类确诊的白血病患者20例,男13例,女7例。初发急性白血病17例［其中有3例在其白血病缓解期(CR)和(或)复发期(R)进行复查］，慢性粒细胞白血病（慢粒)3例。非恶性血液病7例,男4例,女3例。正常健康人8例,男、女各4例。白血病细胞系HL-60、K562、HIMeg细胞株。

　　2　引物合成　根据IRF-1基因cDNA序列^［5］,设计合成的引物碱基顺序如下:I-1：5′-TCTTCCCTCTTCCACTCGGAGTCG-3′，I-2：5′-TGGCACAGCGAAA-

　　GTTGGCC-3′，扩增片段为第2，3，4外显子,长度356bp。β-actin基因引物顺序为，B-1：5′-AACGGCTCCGGCATGTGCAA-3′，B-2：5′-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3′，扩增第1，2外显子，长度108bp。上述引物由中国科学院上海细胞研究所合成。

　　3　细胞总RNA提取　按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA^［6］。

　　4　逆转录-聚合酶链反应^［7］

　　4.1　逆转录反应：20μl体系内,包括2μg细胞总RNA，2.5U/μl MMLV逆转录酶,50pmol随机引物，1U/μl RNA酶抑制剂，500μmol/L dNTPs，1×PCR缓冲液，5mmol/L MgCl₂。42℃反应30分钟，99℃加热5分钟，4℃保存。

　　4.2　聚合酶链反应：50μl体系内,包括1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTPs，62.5pmol IRF-1基因引物或25pmol β-actin基因引物，Taq酶2U，1μg总RNA来源的cDNA模板。94℃变性45秒，55℃退火50秒，72℃延伸1.5分钟,循环35周,每次均设空白对照和肝脏组织细胞为阳性对照。

　　5　聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染显色　5μl PCR扩增产物经10％乙醇，1.13％硝酸(固定液)处理20分钟,水冲洗2～3次。12mmol/L硝酸银(染色液)处理10分钟,水冲洗2～3次。3％碳酸钠，0.06％甲醛(显影液)处理1分钟,晾干。

　　6　吸收光密度扫描　日本Sharp公司JX330扫描仪，Compaq.575计算机，Image-master.TM软件在相同本底下处理凝胶扫描值。

　　7　统计学处理　t检验,相关分析。

结果和讨论

　　1　我们采用RT-PCR方法扩增IRF-1基因片段,以β-actin基因为参照,银染分析扩增产物,以期相对定量地分析IRF-1基因的表达情况。正常健康人骨髓细胞(8例)均检测到特异性IRF-1和β-actin基因片段,扫描值为：IRF-1 1.04±0.04，β-actin 1.73±0.06，IRF-1/β-actin 0.60±0.03。我们取IRF-1/β-actin＝0.6为正常扫描值1.00，作为IRF-1基因相对正常表达值(R.IRF-1)。7例非恶性血液病患者IRF-1基因表达与正常组无明显差异(0.98±0.04，P＞0.01)。

　　2　白血病患者检测结果见附表，K562、HL-60、HIMeg细胞系中IRF-1基因表达分别为0.93,0.28和0.20。17例急性初发白血病患者中有3例未检测到IRF-1基因表达,其IRF-1基因是否缺失,需作进一步研究证实；5例表达低于0.4，明显低于正常对照；4例在0.4～0.7之间；5例大于0.7。2例慢粒急变患者IRF-1基因表达也低于0.7。IRF-1基因表达缺失或下降与白血病FAB分类及白血病细胞比例高低无关(P＞0.05)，提示部分白血病的发生机制可能与IRF-1基因表达缺失或下降引起造血细胞恶性转化有关。

　　3　17例初发急性白血病患者中有8例未检测

附表　白血病患者中IRF-1基因表达情况

　　到IRF-1基因或表达低于0.4，其中3例经标准化疗后获完全缓解，CR率仅36.5％；9例IRF-1基因＞0.4者中有7例完全缓解，CR率为77.8％。同时，我们对3例初发白血病患者作了缓解期追踪观察，2例IRF-1基因表达大于0.7，1例为0.26,该患者一个月后即复发，IRF-1基因表达降至0.13，在治疗过程中死亡(见附表)。上述结果表明，IRF-1基因表达显著下降可能与患者的预后不良有一定关系,但明确的结论及其机制尚需进一步扩大样本量及作长期随访深入研究。

参 考 文 献

　　1　Weinberg RA,Edward W,Nibert M,et al.Oncogenes,antioncogenes,and the molecular base of multistep carcinogenes.Cancer Res,1989,49:3713-3720.

　　2　Nobuyuki K,Masahiko H,Kitagawa T,et al.Cellular commitment to oncogene-induced transformation or apoptosis is dependent on IRF-1.Cell,1994,77:829-839.

　　3　Hisashi M,Eiichi O,Susamu T,et al.Structure and regulation of the human IRF-1 and IRF-2 genes.Mol Cellul Biol,1994,14:1500-1509.

　　4　Chery L,Cordelia E,Maria G,et al.Deletion of IRF-1,mapping to 5q31.1, in human leukemia and preleukemic myelodysplasia.Science, 1993,259:968-974.

　　5　Ying Y,Simon H,Margaret F,et al.Human IRF-1:intron-exon organization.DNA Cell Biol,1992,11:605-611.

　　6　Piotr G,Nicoletta H.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156-159.

　　7　Innis M,Gelfand D,Tracy M,et al. PCR protools,a guide to method and applications.Acad N Y，1990,42:1476-1485.

(收稿：1996-11-21　　修回：1997-07-16)

(校对：王叶青)