白血病患者WT1基因的表达及其临床意义

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论　　著

作者：吴晓雄　汪月增　裴雪涛　楼方定　王立生　徐黎　周绮　韩晓萍

单位：100853　北京，解放军总医院(吴晓雄、汪月增、楼方定、周绮、韩晓萍)；军事医学科学院放射医学研究所(裴雪涛、王立生、徐黎)

　　关键词： 白血病；Wilms肿瘤基因；聚合酶链反应；微量残留病

　　摘要　目的：探讨WT1基因在白血病细胞中的表达及其临床意义。方法：应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定K562、HL-60、TF-1及U937四株白血病细胞系，45例白血病患者，15名正常人外周血及10例非血液病患者正常骨髓细胞WT1基因的表达。结果：K562、HL-60及TF-1三株白血病细胞系均高度表达WT1，而U937细胞系未测到WT1。急性髓系白血病(AML)25例中21例、急性淋巴细胞白血病(ALL)11例中8例、慢性粒细胞白血病(CML)急性变者2例、慢性及加速期CML患者7例中1例WT1表达阳性。15名正常人外周血及10例非血液病患者正常骨髓细胞WT1基因表达阴性。结论：WT1基因在大多数急性白血病中表达，与白血病的病程发展可能有关，可作为检测白血病微量残留病的特异性标记。

　　Expression of Wilms’ tumor gene (WT1) in leukemias and its clinical implication 　Wu Xiaoxiong^*,Wang Yuezeng,Pei Xuetao, et al.General Hospitol of PLA,Beijing　100853

　　Abstract　Objective:To elucidate the expression of Wilms’ tumor gene (WT1) in leukemias and its clinical implication.Methods:Expression of WT1 mRNA was detected in four leukemia cell lines,25 AML patients,11 ALL patients,9 CML patients, 15 healthy subjects and 10 non-blood diseases patients by using RT-PCR.Results:WT1 mRNA expression was revealed in K562,HL-60 and TF-1 cell lines, 21 of 25 (84%) AML patients,8 of 11 (73%) ALL patients,2 CML patients in blast crisis and 1 of 7 CML patients in accelerated and chronic phase.WT1 mRNA was undetectable in PBMNC from 15 healthy subjects and in bone marrow cells from 10 non-blood diseases patients.Conclusion:WT1 gene is expressed in the majority of acute leukemias and thus is involved in human leukemogenesis.WT1 is also a new important marker for monitoring MRD in acute leukemias.

　　Key words　Leukemia 　　Wilms’ tumor gene　　Polymerase chain reaction　　Minimal residual diease

　　Wilms肿瘤基因(Wilms' tumor gene,WT1)是最早发现的与Wilms肿瘤的发生、发展有关的基因。该基因位于染色体11p13，编码一个分子量5.2～5.4万的有4个锌指结构的DNA结合蛋白，具有转录调控功能，在不同肿瘤的发生、发展中起重要作用^［1，2］。WT1的表达具有一定的组织特异性，只在胎儿肾脏、睾丸、卵巢及早期造血组织中高度表达。白血病化疗中最主要的问题之一是不能明确化疗后残留白血病细胞的数量，因此准确、敏感地测定化疗后残留白血病细胞就成为目前人们关注的研究课题之一。1993年Miyagi等^［3］报道部分白血病细胞系WT1表达增高，提示WT1在不成熟的淋巴及髓系白血病细胞中表达增高。为此，我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定了多种白血病细胞系及不同种类白血病患者WT1 mRNA的表达以探讨其在白血病发病中的作用及临床意义。

材料和方法

　　1　研究对象

　　1.1　白血病细胞系：K562(慢粒急性红白血病变细胞系)、HL-60(人急性髓系白血病细胞系)、TF-1(红白血病细胞系)、U937(人组织细胞淋巴瘤细胞系)细胞系培养在RPMI 1640(含15%胎牛血清)培养液中，取对数增殖期细胞提取RNA。

　　1.2　临床病例：45例白血病患者经骨髓细胞形态及组化检查，诊断均符合FAB协作组的诊断标准。其中男24例，女21例，年龄14～56岁;急性髓系白血病(AML)25例［包括骨髓增生异常综合征(MDS)转化型2例］，急性淋巴细胞白血病(ALL)11例，慢性粒细胞白血病(CML)9例。均为初治或复发。15名正常人外周血及10例非血液病患者肋骨骨髓作正常对照。

　　2　单个核细胞(MNC)的分离及RNA的提取

　　2.1　取患者或正常骨髓1ml或外周血5～8ml，肝素抗凝，经淋巴细胞分离液(Ficoll,相对密度1.077)1500r/min离心20分钟，取界面层MNC，PBS洗2遍，-80℃保存，用于提取RNA。

　　2.2　RNA的提取：采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法^［4］。紫外线分光光度仪测定RNA的量，甲醛变性电泳鉴定RNA的质量。-20℃保存。

　　3　引物　引物由美国Cybersyn公司合成。WT1引物包括7～10个外显子编码的锌指结构区域^［5］。

　　上游引物：5′-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3′；

　　下游引物：5′-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3′。扩增产物的长度为481bp。

　　β-actin(作内参）引物^［6］：

　　上游引物：5′-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3′；

　　下游引物：5′-ATCACGATGCCAGTGGTACGG-3′。扩增片段为113bp。

　　4　RT-PCR(所用试剂均由Promega公司生产)

　　4.1　逆转录反应：取0.5μg总RNA，65℃加热2分钟，加入5×RT缓冲液2μl ，RNasin 20U，4种dNTP(10mmol/L)混合液1μl,Oligo T₁₅ 0.2μg,AMV 10U,总体积10μl。42℃反应60分钟，96℃5分钟，迅速置-20℃备用。

　　4.2　PCR:取cDNA 1μl依次加入10×缓冲液，4种dNTP,20pmol的WT1引物(β-actin引物为10pmol)，Taq聚合酶2U，25mmol/L MgCl₂ 8μl,总体积100μl。扩增条件：94℃变性1分钟,64℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共34个周期。实验过程中严格设立内(β-actin作内参)、外对照(包括无模板及正常外周血MNC阴性对照)。

　　5　PCR产物的分析　取PCR产物5μl,在2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg/ml溴化乙锭)，以小分子量DNA为标准(北京大学北方生物技术发展中心)。然后照相，分析结果。

结　　果

　　1　白血病细胞系WT1的表达　结果显示，4种白血病细胞系中K562、HL-60、TF-1 3种急性白血病细胞系WT1 mRNA表达阳性，而U937则未见表达(图1)。

　M：小分子标记；1：K562细胞；2：HL-60细胞；3：TF-1细胞；4：U937细胞

图1　白血病细胞系WT1 mRNA的表达

　　2　白血病患者WT1的表达　见附表，检测45例白血病患者骨髓细胞WT1的表达，结果显示：AML25例(包括2例MDS转化型)中有21例(84%)WT1 mRNA表达阳性，ALL11例中8例(73%)表达阳性，CML9例中2例急性变者WT1 mRNA高度表达，慢性及加速期7例中1例表达阳性。15名正常人外周血细胞及10例非血液病患者骨髓细胞均未检测到WT1 mRNA的表达。

　　3　RT-PCR检测WT1的灵敏性　取WT1表达阳性的K562细胞与正常外周血MNC按1∶10，1∶10²，1∶10³，1∶10⁴，1∶10⁵倍比稀释，然后用RT-PCR测定WT1 mRNA，并同时检测bcr/abl mRNA。结果显示测定WT1的灵敏性为10^-3～10^-4(图2)，与检测bcr/abl mRNA的敏感性相似。

附表　白血病患者及正常骨髓细胞WT1的表达

　　M为分子量标准。稀释倍数：1为10⁰；2为10¹；3为10²；4为10³；5为5×10³；6为10⁴

图2　RT-PCR检测WT1 mRNA的敏感性

　　4　WT1与病程的关系　6例WT1表达阳性的白血病患者经化疗达完全缓解(CR)后，4例WT1的表达转阴，2例明显降低，5例CR期WT1阴性的白血病患者(缓解期4～12个月)复发后WT1呈强阳性表达，1例未缓解的患者WT1持续阳性，表明WT1的表达与病程有关，完全缓解后体内白血病细胞的数量仍有不同。

讨　　论

　　Wilms肿瘤基因位于染色体11p13，编码一个具有4个锌指结构的调控蛋白，具有转录激活和抑制双重功能，参与一些造血因子转录的调控，其异常表达与一些肿瘤，如Wilms肿瘤的发生有关^{［1，2，7］}。我们的检测结果为WT1基因在K562、HL-60及TF-1白血病细胞系WT1 mRNA表达阳性，而U937细胞系未见表达。表明WT1在急性白血病细胞系中表达阳性，而在组织性淋巴瘤细胞系中不表达。这说明WT1基因在不同组织细胞中的表达不同。U937细胞系WT1基因未见表达与其源于组织细胞可能有关。45例白血病患者中25例AML有21例(84%)WT1表达阳性，11例ALL有8例(73%)表达阳性，9例CML中2例急性变者均表达阳性，而7例慢性期患者只有1例表达阳性，15名正常人外周血细胞及10例源于非血液病患者肋骨的正常骨髓细胞则未测到WT1，与文献报道^［8，9］的结果相似。提示WT1基因在未成熟的白血病细胞特别是髓系白血病细胞中表达阳性。

　　测定化疗后微量残留病(MRD)对于针对个体制定相应化疗方案及对患者预后进行判断都是关键的一个环节。PCR是最敏感的检测方法，但只能用于具有特异性基因标记，如bcr/abl、PML/RARα的白血病。实验结果表明WT1在大多数急性白血病细胞中表达阳性，而在正常骨髓及外周血细胞中无表达。以K562细胞与正常细胞倍比稀释，然后应用RT-PCR检测WT1 mRNA以确定该方法检测残留白血病细胞的灵敏度，结果其灵敏度达10^-4，与测定白血病细胞的其他特异性基因标记，如bcr/abl相似。本文实验结果说明WT1可作为检测残留白血病微量残留病及预测白血病复发的一个重要基因标记。

　　对6例白血病患者CR前后的WT1

　　mRNA表达进行观察，结果为4例白血病患者CR后WT1 mRNA表达阴性，2例明显降低呈弱阳性，这可能与患者CR后体内残留的白血病细胞量不同有关。5例CR期WT1无表达的患者复发后WT1的表达呈强阳性，1例未达到CR的患者WT1表达持续阳性。在CML中还可看到，CML急性变时WT1表达阳性，慢性期多不表达。以上结果提示WT1基因的表达在白血病中与细胞分化程度，白血病的发生、发展及病程有关。关于WT1在检测残留白血病细胞中的实际应用以及与白血病的发病、预后的关系还有待进一步研究。

　　志谢：本实验过程中兰州军区总医院血液科等单位提供部分病例标本，在此表示衷心的感谢

参 考 文 献

　　1　Call KM,Glaser T,Ito CY,et al.Isolation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms' tumor locus.Cell,1990,60:509-520.

　　2　Gessler M,Poustka A,Cavenee W,et al.Homozygous detection in Wilms' tumor of a zinc-finger gene identified by chomosome jumping.Nature,1990,343:774-778.

　　3　Miyagi T,Ahuja H,Kubota T,et al.Expression of the condidate Wilms' tumor gene,WT1,in human leukemia cells.Leukemia,1993,7:970-977.

　　4　Chomczynski P,Sacchi N.Single-step methods of RNA isolation by acid guanidiniun thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Annal Biochem,1987,162:156-159.

　　5　Inoue K,Sugiyama H,Ogawa H,et al.WT1 as a new prognostic factor and new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia.Blood,1994,84:3071-3079.

　　6　Staynov DZ,Lee TH.Expression of interleukin-5 and granulocyte-macrophage colony-stimulation factor in human peripheral blood mononuclear cells after activation with phorbol myristate acetate.Immunol,1992,75:196-201.

　　7　Wang ZY,Qiu QQ,Deuel TF.The Wilms' tumor gene product WT1 activates or supresses transcription through separate functional domains.J Biol Chem,1993,268:9172-9175.

　　8　Messen HD,Renkl HJ,Rodeck U,et al.Presence of Wilms' tumor gene (WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemias.Leukemia,1995,9:1060-1067.

　　9　Brieger J,Weidmann E,Fenchel K,et al.The expression of the Wilms' tumor gene in acute myelocytic leukemias as a possible marker for leukemic blast cells.Leukemia,1994,8:2138-2143.

(收稿：1997-05-15　　修回：1997-09-02)

(校对：王叶青)