乳腺癌腋窝淋巴结转移血管生成的免疫组化研究

中华肿瘤杂志 1999年第6期第21卷 临床研究

作者：武利存　张维东　刘惠萍　赵斌　孙公甲

单位：武利存　张维东　孙公甲　250062 济南市，山东省医学科学院基础医学研究所；刘惠萍　济南市中心医院病理科；赵斌　山东医科大学校医院

　　关键词： 乳腺肿瘤；淋巴结转移；血管生成；免疫组织化学

　　【摘要】　目的　研究乳腺癌腋窝淋巴结转移的血管生成情况。方法　采用内皮细胞ⅧF-RAg免疫组化染色技术，对37例乳腺癌根治术或改良根治术切除的乳腺癌组织和121枚腋窝转移淋巴结进行免疫组化染色。在100倍视野下通过显微电视系统计数微血管密度(MVD)，并用显微测量器测量转移灶的直径。结果　在121个淋巴结中找到13处微转移灶，其平均直径为(210±37) μm，无血管生成。腋窝淋巴结转移瘤的MVD为89.3±18.4，与乳腺癌组织MVD(93.8±21.8)差异无显著性，且微血管分布不均，周围高于中央。结论　淋巴结微转移灶无血管生成，转移瘤有血管生成。为抑制微转移灶发展成转移瘤，以及抑制转移瘤的生长，抑制血管生成可能是控制淋巴结转移的有效措施。

Immunohistochemical study of angiogenesis of axillary lymph node metastasis in human breast carcinoma　

WU Licun, ZHANG Weidong, LIU Huiping, et al. Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062

　　【Abstract】　Objective　To study angiogenesis of axillary lymph node metastases (including micrometastatic foci and metastatic tumors) in breast carcinoma and the relationship between microvessel density (MVD) and metastasis.Methods　Thirty-seven breast cancer tissues and 121 metastatic axillary lymph nodes were collected from breast cancer patients and studied immunohistochemically. MVD was counted by means of microvideo system under 100×magnification. The diameter of each micrometastasis was measured with a micrometer.Results　The mean diameter of 13 micrometastatic foci was 210±37 μm. No blood vessel formation was found. MVD of the primary tumor and that of metastatic tumor in the axillary lymph node was 93.8±21.8 and 89.3±18.4, respectively (P＞0.05). The disribution of microvessels of the metastatic tumor in the lymph node and that of the primary tumor was similar, being higher at the periphery than at the center.Conclusion　Micrometastatic foci of breast carcinoma in the axillary lymph node do not have new blood vessel formation. Their further growth, however, depends on neo-angiogenesis. Treatment based on inhibition of angiogenesis may be efficacious in the prevention of micrometastatic foci from developing into metastatic tumor in lymph node.

　　【Subject words】　Breast neoplasms　　Lymph node metastasis　　Angiogenesis　　Immunocytochemistry

　　腋窝淋巴结是乳腺癌最早出现、最常见的转移部位，淋巴结有无转移及转移淋巴结的数目一直被认为是影响乳腺癌预后的重要因素。恶性实体肿瘤的生长必须依赖血管生成已是公认的事实。乳腺癌组织的微血管密度(microvessel density, MVD)与转移呈正相关，虽被许多学者证实^［1，2］，但对淋巴结内转移瘤生长和血管生成情况仍需系统研究。我们在用血管生长抑制剂AI-6治疗肿瘤患者的临床试用中发现，AI-6不仅可抑制原发瘤生长和远处转移，而且可使某些淋巴结转移瘤缩小甚至消失。为了解转移至淋巴结的乳腺癌细胞生长是否也依赖于血管生成，我们采用内皮细胞8因子相关抗原(factor Ⅷ-related antigen,ⅧF-RAg) 免疫组化染色技术对乳腺癌及其腋窝淋巴结转移灶的血管生成情况进行定量研究。

　　材料与方法

　　1.标本来源：37例乳腺癌根治术或改良根治术切除的乳腺癌组织及腋窝淋巴结来自济南市中心医院。腋窝淋巴结先经HE染色，326枚中有转移者121枚，无转移者205枚。淋巴结无转移（包括微转移）者不做免疫组化染色。将乳腺癌组织和121枚有转移的淋巴结标本经10%甲醛固定后，石蜡包埋。每个蜡块切3张5 μm厚的切片，用于ⅧF-RAg免疫组化染色。

　　2.免疫组化染色方法：免疫组化染色采用ABC法^［3］。兔抗人ⅧF抗体、生物素化抗兔二抗及ABC 购自北京中山生物技术公司。

　　3.MVD计数标准：计数血管时，选择切片中微血管最多的区域（热区, hot spot）^［1］，在显微镜下放大100倍，通过显微电视系统在监视器上计数，3人同时计数以减少误差。血管内皮细胞被染成棕色，不论有无管腔，凡看到单个孤立内皮细胞或多个内皮细胞紧密排列均计数为1个血管。若有管腔，管腔内红血球数少于8个者方被计数。

　　4.淋巴结微转移灶直径测量：用Olympus显微测量器测定13个微转移灶的直径，取其平均值。

　　5.统计学处理方法：MVD用±s表示，t检验。

　　结果

　　对121枚腋窝转移淋巴结免疫组化染色结果发现，13处微转移灶的平均直径为(210±37)μm，最大者也不超过300 μm，无血管生成（图1）；而淋巴结转移瘤直径则远远＞300 μm，并可见较多微血管，其内皮细胞中有大量棕色颗粒（图2）。在制作组织切片取材时，多数淋巴结由于转移瘤太大无法取全，故看不到完整的淋巴结结构。淋巴结转移瘤的MVD分布不均匀。转移瘤周围的MVD高于中央。淋巴结转移瘤的MVD与乳腺癌组织的MVD比较，差异无显著性(表1)。

图1 乳癌腋窝淋巴结微转移瘤,无血管生成 ABC法 ×400

图2 乳癌腋窝淋巴结转移瘤,可见大量微血管生成,内皮细胞被染成棕色 ABC法 ×400

表1　淋巴结转移瘤与乳腺癌组织的MVD(±s)

　　讨论

　　乳腺癌细胞进入腋窝淋巴结后可能有4种结果^［4］：（1）“过客”，即在局部淋巴结内不停留，继续随淋巴流运行。（2）癌细胞被机体消灭或自行死亡。（3）癌细胞可能以休眠状态存活，无血管生成，称微转移。微转移可被机体杀灭或可形成转移瘤。（4）癌细胞由于获得足够的血液供应（血管生成），增殖生长形成转移瘤。淋巴结转移对生命并无直接威胁，关键的是转移瘤细胞最终要进入血循环而形成远处转移，如肺、骨、脑、肝等而危及生命。因此，抗淋巴转移也是抗转移研究的重要内容之一。

　　“微转移-血管生成-转移”的过程说明淋巴结内转移瘤的生长也必须依赖血管生成来供应其营养，与原发瘤生长必须依赖血管生成相符合。因此，抗血管生成疗法不仅可控制原发肿瘤生长和抗转移^［5-7］，还可抑制淋巴结内转移瘤生长，即亦具有抗淋巴结转移的作用。这就可解释AI-6使淋巴结转移灶缩小或消失的现象。

　　淋巴结内转移瘤的血管生成分布不均现象与原发瘤相似。Folkman^［8］认为癌细胞可分为两种：一种是血管生成性（angiogenic）癌细胞，另一种是非血管生成性（nonangiogenic）癌细胞，这两类细胞增殖生长时具有不均衡性。

　　ⅧF是人内皮细胞的特异性标志，但不能区别内皮细胞是血管内皮还是淋巴管内皮。因为从胚胎发育看，淋巴管内皮也来源于静脉系统^［9］，二者内皮细胞胞浆中均含有Weibel-Palade小体，ⅧF-RAg即存在于该小体中。因此，在计数MVD时，可能也包括少量淋巴管在内。但有些学者认为，肿瘤组织内无淋巴管（至少无功能性淋巴管）存在。目前的技术很难从形态学上鉴别这两种细胞，我们认为，这对所计数MVD影响不大。

　　微转移灶无血管生成，处于休眠状态。Holmgren^［10］认为，无血管期肿瘤的瘤细胞凋亡速率与增殖速率相平衡；而血管期肿瘤由于获得充足的血供，瘤细胞增殖速率大于凋亡速率，转移瘤就会长大。提示抗血管生成疗法可能会抑制微转移灶的血管生成，使其无限期地处于休眠状态。另外，如对那些已形成的转移瘤抑制其血管生成，可使转移瘤因缺乏血供而停止生长甚至缩小。因此，抗血管生成疗法可能成为一有效的抗淋巴转移的有效措施。

　　本课题受山东省科委资助（编号 961226702）

　　参考文献

　　1　Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med , 1991, 324:1-8.

　　2　武利存，朱芳.微血管密度对乳癌预后的意义.国外医学肿瘤学分册， 1996，23：354-356.

　　3　纪小龙主编.诊断免疫组织化学.第1版.北京：军事医学科学出版社，1997.16.

　　4　高进主编.肿瘤学基础及实验.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993.232.

　　5　Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Ann Rev Med, 1998, 49:407-424.

　　6　Effert PJ, Gastl G, Strohmeyer T. Current and future strategies to block tumor angiogenesis, invasion and metastasis. World J Urol, 1996, 14:131-140.

　　7　Marcia B. Designing therapies that target tumor blood vessels. Cancer Res, 1997, 275:482-484.

　　8　Folkman J. Angiogenesis and breast cancer. J Clin Oncol, 1994, 12:441-443.

　　9　Weidner N. Factor Ⅷ-Related Antigen. J Natl Cancer Inst, 1993, 85:674-676.

　　10　Holmgren L. Antiangiogenesis restricted tumor dormancy.Cancer Metastasis Rev,1996, 15:241-245.

(收稿：1999-04-15　　修回：1999-06-08)