凋亡相关基因表达在乳腺癌细胞生长中的作用

中华肿瘤杂志 1999年第6期第21卷 简报

作者：吴炅　邵志敏　江明　陆企夏　韩企夏　沈镇宙

单位：200032 上海医科大学肿瘤医院胸外科

　　细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cki′s)p27^kip1是CDK₂/Cyclin E的抑制蛋白，不仅使细胞周期停滞于G₁期，还可诱导乳腺癌细胞凋亡。我们通过体外实验，分析凋亡相关基因bcl-2基因族、p27^kip1的表达水平与乳腺癌细胞株生物特性的关系，探讨在阿霉素作用后其基因或蛋白产物表达水平的变化。

　　材料与方法　应用体外细胞培养、细胞爬片技术，采用免疫组化、Westem blot方法检测不同ER状态人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231中bcl-2、bax、p27^kip1、PCNA蛋白表达，以及在阿霉素生长抑制实验中上述蛋白表达的改变；Northern blot印迹法检测bcl-xlmRNA在乳腺癌细胞株受阿霉素作用前后的表达；TUNEL检测乳腺癌细胞凋亡，计数凋亡细胞百分率。

　　结果　(1)免疫组化染色结果：MCF-7、MDA-MB-231细胞爬片中，bcl-2、bax阳性染色定位于胞浆，p27^kip1、PCNA阳性染色定位于细胞核。ER(+)细胞株MCF-7中bcl-2、p27^kip1蛋白表达略高于ER(-)的MDA-MB-231细胞株，但差异无显著性；PCNA在增殖较快的MDA-MB-231细胞株中表达高于MCF-7(χ²=5.70，P＜0.05)。阿霉素作用于MCF-7细胞株后，bcl-2、PCNA蛋白表达明显降低，而bax、p27^kipl蛋白表达升高，差异均有显著性；MDA-MB-231细胞株经阿霉素处理后，PCNA表达明显受到抑制，bax蛋白表达升高，bcl-2、p27^kip1蛋白表达改变无统计学意义。(2)TUNEL标记结果：MCF-7细胞中，AI在阿霉素作用后为37%，高于对照组的12%(χ²=16.8，P＜0.001)；MDA-MB-231细胞中，阿霉素处理组AI为31%，对照组为19%(χ²=3.84，P＞0.05)。(3)Westem blot结果：MCF-7细胞中p27^kip1蛋白表达随阿霉素作用时相的延长而逐渐增高，MDA-MB-231细胞则变化不明显。(4)Northern blot显示，MCF-7细胞bcl-xl mRNA表达水平较高，而在MDA-MB-231细胞中基本不表达；MCF-7细胞经阿霉素作用，bcl-xl mRNA表达水平随时相逐渐下降。

　　讨论　细胞增殖周期与细胞凋亡是维持内稳态的两个重要组成部分，二者由多个基因构成复杂的调控体系。抑癌基因p53和p27^kip1不仅可使细胞生长停滞，而且可诱导细胞凋亡。bcl-2基因族中，bcl-2、bcl-xl有抑制凋亡的作用，而bax可促进凋亡。

　　本实验中，MCF-7细胞株表达野生型p53，ER(+)；MDA-MB-231细胞株表达突变型p53，ER(-)。p27^kip1蛋白是G₁期检查点的重要参与者，主要功能是抑制Cdk₂/Cyclin E复合物，阻断细胞增殖进入S期。我们发现MCF-7细胞p27^kip1蛋白表达水平与MDA-MB-231细胞相似，同文献报道相符，支持p27^kip1亦是p53的下游效应基因之一，说明MCF-7细胞野生型p53功能完善，而MDA-MB-231细胞(含突变型p53)p27^kip1蛋白的作用可能是不依赖于p53的。另外，Northern印迹法显示MCF-7细胞bcl-xl mRNA高表达，而MDA-MB-231细胞中不表达，说明乳腺癌细胞存在异质性。TUNEL检测发现，MDA-MB-231细胞AI稍高于MCF-7细胞，同时MDA-MB-231细胞PCNA表达明显高于MCF-7细胞，支持MDA-MB-231是一种增殖旺盛的细胞，细胞死亡也相应加快。

　　许多化疗药物通过诱导细胞凋亡达到杀灭肿瘤细胞的作用。阿霉素是乳腺癌化疗中常用药物，其主要作用机制是使DNA损伤。在阿霉素生长抑制实验中，比较阿霉素处理前后，MCF-7细胞bcl-2、PCNA蛋白表达降低，bax、p27^kip1蛋白表达上调，AI上升。结合我们以前的研究结果，进一步证实MCF-7细胞株具备完善的G₁期检查点调控程序，反映在DNA受损后，细胞增殖、凋亡均受到精确的调节，并且除了p53下游基因p21^wafl/cipl蛋白产物升高外，p27^kipl蛋白表达亦明显升高。p27^kipl蛋白作用于G₁期后期的细胞，其表达上调的意义可能在于确保DNA受损的细胞停滞于G₁期。然而在MDA-MB-231细胞中，上述改变不存在，仅发现PCNA表达下降、bax表达上升有统计学意义，说明在含突变型p53、ER(-)、分化差的人乳腺癌细胞株中，阿霉素杀灭癌细胞的机制并非DNA损伤后的一系列有序的改变，而可能是细胞毒性作用或其他机制。

(收稿：1998-12-09　　修回：1999-04-23)