细胞凋亡及其相关基因与乳腺癌预后关系的研究

中国肿瘤临床 2000年第7期第27卷 论著

作者：范宇　傅西林　王颍　郎荣刚

单位：范宇(天津医科大学附属肿瘤医院乳腺癌研究室　天津市　300060)；傅西林(天津医科大学附属肿瘤医院乳腺癌研究室　天津市　300060)；王颍(天津医科大学附属肿瘤医院乳腺癌研究室　天津市　300060)；郎荣刚(天津医科大学附属肿瘤医院乳腺癌研究室　天津市　300060)

关键词：细胞凋亡；bcl-2；p53；乳腺癌；预后

　　摘要　目的：分析乳腺癌中凋亡细胞数量、凋亡相关基因—bcl-2、p53的表达、细胞增殖标志物PCNA(增殖细胞核抗原)的表达，与影响乳腺癌预后的因素(肿瘤大小，TNM分期，淋巴结转移情况，雌孕激素受体情况等)之间的关系及其对预后的影响。方法：凋亡细胞的检测采用原位DNA缺口末端标记TUNEL法，bcl-2、p53、PCNA、ER(雌激素受体)及PR(孕激素受体)检测采用免疫组化LSAB法。结果：本组200例乳腺癌中，bcl-2阳性率为51%，bcl-2高表达及ER、PR阳性，肿瘤体积小，肿瘤增殖活性低，p53阴性，与ER、PR阴性，肿瘤体积大，肿瘤增殖活性高及p53阳性者相比，差异具有显著性(P＜0.01)。bcl-2高表达者无瘤生存率及总生存率均明显高于bcl-2低表达者。差异具有显著性(P＜0.001)。本组乳腺癌的平均AI为1.89%(范围0～14.8%)。PI为18.37%±7.51%，通过相关性分析显示，AI与PI呈显著性正相关，(r=0.89，P＜0.001)。结论：本研究显示，在乳腺癌组织中，bcl-2表达抑制bcl-2表达抑制凋亡的发生，突变型p53蛋白的表达抑制bcl-2的表达，调亡率随增殖率的增加而增加，bcl-2高表达、凋亡率低的乳腺癌患者其预后多好于bcl-2低表达而凋亡率高者。

Study on the relationship between Apoptosis and Its Related Genes and the Porgnosis of Breast cancer

Fan Yu　Fu Xilin　Wang Ying　et al(Tianjin Cancer Hospital,Tianjin)

　　Abstract　Objective:To study the impact of apoptosis and its related genes on the prognosis of patients with breast cancer.Methods:By using LSAB immunohistochemical technic the expresssion of p53,bcl-2,PCNA and ER-PR were determined in 200 cases of breast cancer.Meanwhile the apoptotic cells in 50 cases were studied with TUNEL technic.Results:The overall positive rate of bcl-2 expression was 51%.The high expression of bcl-2 coincided with those good prognostic factors such as the presence of ER and PR,small tumor size,low activity of proliferation rate and absence of p53 (P＜0.01).The disease-free survival and overall survival of patients with expression of bcl-2 were significantly longer than those without bcl-2 (P＜0.001).The average index of apoptosis (AI) was 1.89%.AI was associated with those poor factors of prognosis such as absence of ER and PR and high proliferation rate etc (P＜0.01).The average index of PCNA (PI) was 18.37±7.51%,and was closely related with AI(r=0.89,P＜0.001).Conclusion:In breast cancer,the bcl-2 expression inhibits cellular apoptosis,the expression of p53 down regulates the expression of bcl-2 and AI is closely associated with pI.Therefore,high expression of bcl-2 and low PI are the good prognostic factors of breast cancer.

　　Key Words　Apoptosis　bcl-2　p53　Prognosis　Breast carcinoma

　　传统上，细胞增殖被看作是肿瘤生长率的决定因素及影响患者预后的重要因素，而对于细胞死亡的作用则很少有研究。目前，人们认识到肿瘤的生长与发展不仅取决于细胞的增殖率，也决定于细胞的死亡率^［1，2］。近年来，另一种细胞死亡途径引起人们的关注，这就是细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。细胞凋亡是由Kerr等于1972年首次提出的一种与坏死明显不同的细胞死亡现象，是有核细胞在一定条件下通过启动自身内部的机制而发生的细胞死亡过程^［3］。与细胞增殖一样，凋亡是一个主动的过程，它需要蛋白质的合成及细胞核内DNA的降解^［4］。有报道指出，肿瘤的发病与细胞凋亡及增殖的失衡密切相关^［3］。虽然在多种肿瘤中证实细胞增殖可以预测患者的生存率，但有关细胞凋亡在预后中的意义则少有报道。

　　本研究通过检测乳腺癌中的凋亡细胞数量、凋亡相关基因—bcl-2、p53的表达、细胞增殖标志物PCNA(增殖细胞核抗原)的表达，结合已知的影响乳腺癌预后的因素(肿瘤大小，TNM分期，淋巴结转移情况，雌孕激素受体情况等)，分析它们之间的关系及其对预后的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　我院1988～1989年间收治有完整临床病理及随访资料的200例乳腺癌患者为本研究的对象，均为女性。年龄22～76岁，平均51.2岁。乳腺癌组织学分型及临床分期按文献［5］方法。其中原位癌18例，浸润性特殊型癌24例，浸润性非特殊型癌158例。Ⅰ期108例，Ⅱ期50例，Ⅲ期42例。全部病例均随访9年以上。TUNEL检测试剂盒购自宝灵曼公司，p53及PCNA单克隆抗体为丹麦DAKO公司产品，ER、PR、bcl-2单克隆抗体及S-P试剂盒为美国ZYMED公司产品。

　　1.2　方法

　　凋亡细胞的检测采用原位DNA缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidy Transferase-mediated digoxigenin-11-dUTP nick end labeling，TUNEL)法：从本组中随机选择50例标本(其中Ⅰ期28例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例)进行凋亡细胞检测。石蜡切片62℃温箱过夜，常规脱蜡至水，10μg/ml蛋白酶K室温30分钟，蒸馏水洗，0.05mol/L tBS洗，50μl/片 TUNEL反应液37℃60分钟，0.05mol/L TBS 3分钟×4，Buffer a 15分钟，0.05mol/L TBS 3分钟×4，Buffer A 5分钟，50μl/片碱磷酶标记的抗荧光素抗体37℃30分钟，Buffer A、B、C各5分钟，CIP+NBT显色室温120分钟，蒸馏水终止显色，自然干燥，封片。bcl-2、p53、PCNA、ER(雌激素受体)及PR(孕激素受体)检测采用免疫组化LSAB法：石蜡切片常规脱蜡至水，置0.001mol、pH6.0枸橼酸缓冲液中经微波修复抗原。以已知阳性片作阳性对照，以TBS替代—抗作为阴性对照。

　　1.3　结果判定

　　TUNEL染色阳性物质位于细胞核，凋亡指数(Apoptostic Andex，AI)及PCNA指数(PI)的确定通过每张切片选择10个高倍视野(图1)，观察1000个肿瘤细胞，计算其中平均阳性细胞比例。我们将AI≥1%的病例作为凋亡指数高组，AI＜1%的病例作为凋亡指数低组，PI≥20%作为PCNA指数高组，PI＜20%为PCNA指数低组。p53阳性物质位于胞核(图2)，bcl-2阳性物质位于胞浆、核周，阳性细胞数超过20%计作阳性(图3)。

图1　TUNEL阳性物质位于细胞核(×400)

图2　p53阳性物质位于细胞核(×100)

图3　bcl-2阳性物质位于胞浆及核周(×100)

　　1.4　统计学处理

　　采用χ²检验、log-rank检验及相关分析。

　　2　结果

　　2.1　bcl-2与其它影响预后因素之间的关系(表1)

　　p53阳性者其bcl-2表达下降。

　　2.2　细胞凋亡指数与其它预后因素的关系

　　见表2。本组乳腺癌的平均AI为1.89%(范围0～14.8%)。细胞凋亡指数高与许多预后不良的因素相关，差异具有显著性。

表1　200例乳腺癌bcl-2表达与各种预后因素的关系

表2　50例乳腺癌凋亡指数与各种预后因素的关系

　　2.3　bcl-2表达与临床预后的关系

　　bcl-2高表达者无瘤生存率及总生存率均明显高于bcl-2低表达者。差异具有显著性。见图4，5。

图4　bcl-2阳性及阴性患者总生存率曲线(Kaplan-Meier)

图5　bcl-2阳性及阴性患者无瘤生存率曲线(Kaplan-Meier)

　　2.4　细胞凋亡与增殖的关系

　　本组患者的平均PI为18.37%±7.51%，通过相关性分析显示，AI与PI呈显著性正相关(r=0.89，P＜0.001)。值得注意的是，本组临床标本中肿瘤细胞的凋亡率随着其增殖率的增加而增加，且凋亡率高者预后差，与我们所预期的正好相反。

　　3　讨论

　　bcl-2基因是凋亡研究中最受重视的癌基因之一，它首先被从滤泡型B细胞淋巴瘤的14和18染色体t(14:18)易位断裂点克隆^［6］，其染色体异位导致蛋白产物(bcl-2蛋白)的过表达。虽然对于凋亡的调节机制目前还不完全清楚，但bcl-2是体内外抑制细胞凋亡的重要因子已被证实^［7，8］。其基因产物广泛分布于除肌肉和肝脏以外的许多正常组织，也可见于胃肠肿瘤、肾癌及乳腺肿瘤。近年来，有学者指出它的过度表达是一个可靠的临床预后好的指标^［9］。也有研究表明bcl-2影响肿瘤细胞的分化，正如Bosari等人在大肠肿瘤的研究中所见到的，bcl-2表达见于所有的腺瘤，而在腺癌中则有50%的病例无bcl-2表达^［10］，说明随着肿瘤的去分化，其bcl-2表达下降。

　　有作者报道乳腺癌组织中bcl-2基因的表达及细胞凋亡在预后中的意义，但结果不一。有学者提出bcl-2蛋白的表达抑制凋亡的发生，凋亡率高者预后差^{［11，12］}，但也有认为凋亡指数高者预后好^{［13，14］}或与预后无关^［15］。本组结果显示，bcl-2高表达者凋亡指数低且患者生存率高。这与国外的一些研究结果一致^{［11，12，16～18］}。Gee等提出，bcl-2蛋白是由雌激素调节的，此蛋白多局限在那些拥有ER的乳腺癌细胞中，这是内分泌治疗的必要条件^［9］。因而，bcl-2高表达者预后好可能是由于其对激素治疗反应好所致^{［19，20］}。

　　对于细胞增殖与凋亡二者以何种机制发生联系，目前尚无统一的结论。从理论上讲，细胞丢失得多则肿瘤应生长缓慢且患者复发及死亡的晚；肿瘤的生长侵袭部分与细胞增殖与凋亡间的平衡有关。当细胞增殖率高而凋亡率低时，就可能导致总的生长率高及更强的侵袭力。本组临床标本中凋亡率随细胞增殖率的升高而升高，且属于恶劣的预后因素，而非想象的那样，凋亡率与增殖率呈负相关，凋亡率越高，预后越好。与文献中有关肺癌^［21］、膀胱癌移行细胞癌^［22］、肾细胞癌^［23］及胆囊癌^［24］中的报道一致。Evan等指出，在某些情况下，刺激增殖的基因c-myc也刺激凋亡^［25］，另外，如果在细胞分裂增殖周期中某个恰当的时间细胞依赖性激酶被激活，也会有刺激凋亡的作用^［26］。这些发现支持Stewart等提出的，凋亡也可以被某些不协凋的生长信号所启动的观点^［27］，这与我们的发现即凋亡率随增殖率的增加而增加的结论一致。

　　p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最为密切的基因之一，它在调节细胞周期及诱导凋亡中起着重要作用^［28］。人p53抑癌基因位于17号染色体短臂上，因其基因产物的分子量为53KD而得名，通常谓之野生型p53。当其一旦丢失或发生突变，改变原有的功能引起细胞生长的失控并发生恶变，即为突变型p53。由于野生型p53蛋白的半衰期仅6～12分钟，故在正常情况下它不能聚集到足够的使免疫组化方法可以检测得到的量。而突变型p53蛋白较稳定，半衰期也较长(2～12小时)。当在细胞中检测到p53蛋白时，说明p53基因发生了突变。因此一般情况下，p53蛋白的过量表达常提示预后较差。研究证实，野生型p53诱导凋亡，其肿瘤抑制功能是基于其可以诱导G₁期停滞和(或)导致细胞凋亡^［29］。另一方面，突变型p53则延迟凋亡^［30］。p53介导细胞凋亡的机制可能和它的转录调节因子的功能有关，因此可以被其它基因的转录促进剂或抑制剂所介导。另一方面，突变型p53能够抑制凋亡。有研究显示，p53表达的裸鼠，各类肿瘤的发生率高，其机制可能是由于细胞对抗凋亡刺激因素的能力有所增高。

　　我们的结果显示，在乳腺癌组织中经免疫组化检测p53蛋白表达增高者bcl-2表达下降，提示突变型p53能够下调bcl-2的表达；另外，p53蛋白的聚积与凋亡活性增加有关，这与Lipponen在膀胱癌及Soini在胚胎性肿瘤中的报道一致^{［22，31］}。Peng提出，在某些肿瘤，即使肿瘤细胞p53阳性，却没有p53基因突变的表现^［32］。因此，这类病例中p53蛋白的表达可能是聚积下来的野生型p53，后者可能是不明原因的半衰期的延长。这一系列由于野生型p53蛋白的聚积转而导致p53介导的凋亡过程的延长，可能赖以部分地解释为什么p53阳性病例其凋亡程度反而高的现象。与此相反，也有人提出突变型p53可以下调bcl-2的表达^{［33～35］}，取决于其突变点在哪里，因为p53是通过bcl-2一类基因的相互作用而调节凋亡的^［1，2］。

　　总之，本组结果显示，在乳腺癌组织中，bcl-2表达抑制凋亡的发生，突变型p53蛋白的表达抑制bcl-2的表达，凋亡率随增殖率的增加而增加，bcl-2高表达、凋亡率低的乳腺癌患者其预后多好于bcl-2低表达而凋亡率高者。

　　本文课题受天津市卫生局科研基金资助

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1999-12-17

2000-05-10