腋窝淋巴结阴性乳腺癌淋巴结微小转移及c-erbB-2扩增的研究

中国肿瘤临床 2000年第6期第27卷 论著

作者：安伟德　郭文斌　胡祥　张靖秋

单位：安伟德（大连医科大学附属第一医院普外科，辽宁省　大连市　116011）；胡祥（大连医科大学附属第一医院普外科，辽宁省　大连市　116011）；郭文斌（辽宁省大连市中心医院普外科）；张靖秋（辽宁省营口市老边区医院外科）

关键词：乳腺肿瘤淋巴结微小转移上皮细胞膜抗原c-erbB-2

　　摘要：目的:探讨腋窝淋巴结阴性（ANN）乳腺癌淋巴结微小转移（LNM）以及原发灶c-erbB-2扩增的临床意义。方法:应用免疫组化方法对58例ANN乳腺癌LNM进行检测，利用差异PCR技术测定对应原发灶c-erbB-2扩增。结果:25.8％病例存在LNM，31.0％伴有c-erbB-2扩增；在低分化乳腺癌组中，LNM阳性率明显高于高分化组；肿瘤直径＞2.0cm者的LNM检出率显著高于直径≤2.0cm患者；在LNM阳性组中，c-erbB-2扩增率明显高于阴性组。结论:免疫组化可大大提高乳腺癌病人微小转移检出率，c-erbB-2扩增在乳腺癌转移早期即可发生。

Study on Micrometastases in Axillary Lymph nodes and c-erbB2 Amplification in Axillary node-negative Breast Cancer

An Weide　Guo wenbin　Hu Xiang et al（First Affiliated Hospital of Dalian University of Medical Sciences,Dalian）

　　Abstract　Objective:To explore axillary lymph nodes metastases (LNM) and c-erbB2 amplification in axillary node-negative (ANN) breast cancer and its clinical significance.Methods:The LNM was examined in 58 cases of ANN breast cancer by immunohistochemistry.The c-erbB2 amplification of tumor tissues was studied in the same patients by differential PCR.Results:The positive rate of LNM and c-erbB2 amplification were 25.8％ and 31.0％ respectively.In the poorly differentiated group,the positive rate of LNM was significantly higher than that of well differentiated group.In the cases of tumor ＞2cm,LNM rate was obviously higher than that of ＜2cm.In the LNM positive group,c-erbB2 amplification rate was significantly higher than that of negative group.Conclusion:The data suggest that immunohistochemical technique can greatly facilitate the detective rate of micrometastases,and c-erbB2 amplification usually occurs at the early stage of cancer metastases.

　　key Words　Breast cancer　Lymph node micrometastases　Epithelial membrane antigen

　　腋窝淋巴结阴性(axillary node-negative，ANN)乳腺癌患者虽然预后良好，但仍有25％患者最终死于本病^[1]。因此，设想这些失败的患者在手术时已出现区域淋巴结内微小转移（lymphatic node microtastases，LNM)，但因病灶太小而常规检查难以发现^[2]。c-erbB-2扩增与乳腺癌预后参数关系已有报道，但该基因扩增在肿瘤亚临床转移阶段中变化研究极少。本研究应用免疫组化方法对58例ANN乳腺癌LNM进行检测，利用差异PCR（differentional pCR，dPCR)，对相应原发灶c-erbB-2扩增予以研究并与临床因素进行相关分析。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料来源

　　58例ANN乳腺癌及正常腺体均来自我院1997～1999年期间住院患者手术切除标本，并有病理学诊断证实。

　　1.2　免疫组化染色

　　取乳腺癌腋窝淋巴结石蜡组织块重新切片，制成4μm玻片待检。切片经烘烤、脱蜡、梯度酒精入水。封闭非特异性抗原，加入由DAKO公司提供1：40稀释抗上皮细胞膜单抗（抗EMA），按ABC操作常规进行。

　　1.3　乳腺癌原发灶DNA样品制备

　　按酚、氯仿/异戊醇方法进行。

　　1.4　dPCR引物及扩增条件

　　c-erbB-2及β-actin引物序列^[3，4]。在20μl体系中进行扩增，DNA模板为0.1μg，c-erbB-2引物一对各20pmol、β-actin引物一对各20pmol、10×PCR缓冲液2μl、BSA2.5μg、dNTP各0.5mmol/L、Tag酶2u。94℃预变性5分钟；94℃60秒、55℃60秒、72℃60秒，共30循环，延身伸72℃300秒。

　　1.5　光密度扫描及分析

　　摄影负片用光密度仪进行电泳道的纵向扫描，根据各区带对光的吸收，求出c-erbB-2带与β-actin带比值确定是否存在c-erbB-2扩增。

　　1.6　统计学方法

　　所有数据采用卡方检验。

　　2　结果

　　2.1　LNM判断标准

　　EMA抗原定位于细胞浆中，阳性细胞为棕黄色，阴性细胞不着色。在淋巴结内发现EMA标记细胞为外来成份，结合组织细胞的结构和形态确诊为微小转移（LNM）阳性。

　　2.2　c-erbB-2扩增判断标准

　　随机抽取12例乳腺正常腺体作为对照，以单拷贝基因（β-actin）作为内参照，应用dPCR方法检测靶基因（c-erbB-2）拷贝数，可用以下公式计算：

靶基因考贝数=A1/A2

　　[A1：靶基因dPCR吸光度（旧称光密度OD值）；A2：参照基因dPCR吸光度值]

　　但实际上计算时常因主带旁有较浅的杂带，使两带的扫描峰底部分融合，此时积分仪无法正确区分，影响结果的可靠性。因此必须改进计算方法。鉴于各峰均近似三角形，可用求三角形面积的方法计算相对A值。根据扫描图分析，两峰融合部分高度不超过主峰的1/2，这样可准确测量半高处的底宽。因参照基因扩增DNA片段为318bp，较目的基因98bp大2倍，故应较正，上述公式可改写为：

　　经核正后，以c-erbB-2拷贝数＞1.84者为c-erbB-2扩增。

　　2.3　乳腺癌LNM结果

　　在58例ANN乳癌中，LNM阳性率为25.8％（15/58）；在低分化乳癌中，LNM阳性率明显高于分化组（P＜0.05）；在肿瘤直径＞2.0cm组的LNM阳性率显著高于≤2.0cm组（P＜0.05）；而LNM与雌激素受体状态关系不明显（图1、表1）。

图1　在淋巴结中EMA表达阳性肿瘤细胞团(ABC×400)

表1　58例ANN乳腺癌患者LNM与临床预后因素关系

　　2.4　LNM与c-erbB-2扩增的关系

　　c-erbB-2扩增率为31.0％（18/58）；在LNM阳性组中，c-erbB-2扩增率明显高于阴性组（P＜0.05）（图2、表2）。

图2　c-erbB-2及β-actindPCR扩增结果，

　　m:PBR322/HaeⅢDNA标志物

　　1正常乳腺腺体；2乳腺癌组织，c-erbB-2无扩增；

　　3、4乳癌组织，c-erbB-2扩增

表2　58例ANN乳腺癌LNM与c-erbB-2扩增的关系

　　3　讨论　　研究表明，在ANN乳腺癌中肿瘤复发、转移与LNM关系密切^[5]。而目前临床上的常规检查难以确认ANN患者LNM存在与否，利用免疫组化技术可以显著提高检测的灵敏度与精确性。

　　乳腺癌来源于上皮组织，具有上皮组织细胞生物学特性，而淋巴结则不表达相关抗原^[6]。

　　结果发现，ANN乳腺癌中有25.8％病例伴有LNM，与文献报道相一致^[6]。在低分化乳腺癌或肿瘤直径＞2.0cm组中，LNM明显增高，这与肿瘤分化程度越低，直径越大出现淋巴结转移几率越高的规律相符合。

　　有关c-erbB-2扩增与乳腺癌转移的关系已有报道，但都以临床常规病理检查确定转移的有无为基础，且所选择的肿瘤转移组几乎都为中晚期病例，而有关该基因扩增在肿瘤转移的亚临床阶段变化研究甚少。本研究表明，在LNM阳性组中，c-erbB-2扩增率明显增高，提示该组患者预后差。

　　本研究结果证实，应用免疫组化方法检测ANN乳腺癌LNM是行之有效的，c-erbB-2基因扩增在乳腺癌转移早期即可发生，这对ANN乳腺癌中高危组病例的筛选提供了一种重要的方法。

(杨红欣 校对)

　　本文课题受大连市科委科研基金重点资助

　　参考文献

　　1，吴进冬,余子豪,李国民,等.腋窝淋巴阴性乳腺癌患者淋巴结中微小转移的检测及其临床意义.中华肿瘤杂志,1996；18：289～91

　　2，Cote BRJ,Rosen PP,Lesser ML,et al.Prediction early relapse in patients with operable breastcancer by detection occult bone marrow micrometastases.J clin oncol,1991,9:1749～55

　　3，Liu E,Urano T,Goi T,et al.The HER2(c-erbB-2) is frequently amplified in situ carcinomas of breast.Oncogene,1992,7(9):1027～32

　　4，Ponter PP,Flatow U,King CR,et al.Evolutioary conservation in the untranslated regions of actin mRNA:DNA sequnce of a human beta-acting cDNA.Nucleic Acids Res,1984,12(11):1687～92

　　5，Molino A,Pelosi G,Turazza M,et al.Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer patients:correlations with clinical and pathological features and prognosis.Breast Cancer Research and Treatment,1997,42:23～30

　　6，Ghossen RA,Rosa J.Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumour cells.Cancer,1996,78:10～6

1999-09-20收稿

　　2000-01-25修回