膀胱癌中nm23－H1基因突变及表达的意义

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著

作者：万宏　吴明明　强万明　虞颂庭　刘涛

单位：万宏（天津医科大学总医院　天津市300052）；吴明明（天津医科大学总医院　天津市300052）；强万明（天津医科大学总医院　天津市300052）虞颂庭（天津医科大学总医院　天津市300052）；刘涛 （天津医科大学总医院　天津市300052）

关键词：nm23－H1基因；膀胱癌；基因表达；基因突变

　　摘要　目的：探讨nm23－H1基因在膀胱癌中突变及表达的意义。方法：应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT－ PCR)和银染单链构象多态性(SSCP)方法检测nm23－H1基因在25例膀胱癌组织及15例对照组织中突变和表达情况。结果：对照粘膜中未检测出nm23－H1基因突变，而在25例膀胱癌组织中发现6例出现PCR产物单链泳动状态异常， 异常率为24％。癌组织和对照组织均有nm23－H1基因mRNA的表达，88％(22/25)的癌组织中nm23－H1mRNA高表达，但在不同分期、分级中未见统计学差异。随着肿瘤恶性度 的增加，nm23－H1基因突变率和基因相对表达量的增加有协同性。结论：提示nm23－H1基因高表达可能与膀胱肿瘤恶性表型的出现及肿瘤恶性进展有关；基因突变可能是癌组织中基因产物表达增高的原因之一。

Mutation and Expression of nm23－H1 gene in Bladder Carcinomas

Wan Hong Wu Mingming Yu Songting（Department of Urology, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin）

　　Abstract Objective: To probe the significance of the mutation and expression of nm23－ H1 gene in bladder cancers. Methods: The mutation and expression of nm23－ H1 gene were detected in tissues from 25 bladder tumors and 15 normal bladder mucosa with quantitative reverse transcription－ polymerase chain reaction (RT－ PCR) and silver staining single－ strand conformation polymorphism (SSCP) methods. Results: No nm23 gene mutation was detected in normal mucosa, but it was detected in 24％(6/25) of bladder tumors in which one was recurrent tumor and another was multiple bladder tumors. The increased mutation rate escalated along with the increasing malignancy of tumor, but without statistical significance. The nm23－ h1 gene mRNA were expressed in all the malignant and normal tissues. Different mRNA levels were evaluated in tumor and normal tissues. High level of nm23－ H1 mRNA were expressed in 88％ (22/25) of bladder tumors and there was no significant quantitative difference of nm23－ H1 mRNA among the different grades and stages of tissues. Conclusion: It is concluded that with the increased malignant degree of tumor, nm23－ H1 gene mutation may be one of the reasons for its high expression. Furthermore, high expression of nm23－ H1 gene mRNA may play a role in tumorigenicity and progression of bladder carcinoma.

　　Key Words nm23－ H1 gene Bladder tumor Gene mutuation Gene expression

　　nm23－H1基因与肿瘤转移、增殖及浸润有关。本文采用半定量RT－PCR及银染SSCP方法探讨nm23－H1基因在膀胱癌发生、发展中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　组织标本

　　25例肿瘤组织取自1996～1998年我科手术切除标本。其中：男21例，女4例；平均年龄62岁(40～80岁)。表浅型8例；浸润型17例。15例对照组织取自膀胱癌患者距癌灶 至少4cm处膀胱粘膜或非癌患者膀胱粘膜。病理标本均在手术切除离体后半小时内获得，保存于－80度冰箱中。

　　1.2　引物

　　nm23－H1引物(336bp)：

　　上游TTGAGCGTACCTCCATTGCGATC

　　下游TTTGCACTCTCCACAGAATCAC

　　β₂－微球蛋白引物(285bp)：

　　上游ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT

　　下游AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT

　　1.3　实验方法

　　1.3.1RNA提取采用酸苯酚萃取法提取组织RNA，测定 OD260/OD280比值，确定RNA浓度和纯度。

　　1.3.2cDNA合成20μl体系中分别加入lμgRNA，0.5mmol/LdNTP，5μ mol/LN6随机引物，10mmol/LDTT，lU/μlRNA酶抑制剂，10U/μlM－ mLV逆转录酶，混匀，37℃水浴1小时。

　　1.3.3半定量RT－PCR以持家基因β2－微球蛋白作为内参 照，PCR反应控制在平台期结束。所得产物经2％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭荧光染色，灰度扫描仪定量分 析DNA条带的荧光强度。nm23－H1基因相对表达强度=nm23－ h1扫描密度/β₂－微球蛋白扫描密度。

　　1.3.4银染SSCP取10μlPCR产物和10μl变性缓冲液混匀，96℃ 变性8分钟，冰水中冷却立即上样进行非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，10mA恒电流6小时，银染显色。以正常膀胱粘膜做对照，观察是否出现异常泳动带。

　　1.4　结果统计

　　t检验。

　　2　结果

　　2.1　15例对照粘膜组织中未发现SSCP异常泳动带，而25例膀胱癌组织中有6例出现异常SSCP泳动带，异常率为24％ (6/25)见图1，2。6例SSCP阳性标本中2例为复发和多发性膀胱肿瘤。nm23－H1基因突变率随着肿瘤分期、分级的增高有上升趋势，但差异尚不具有统计学意义。

图1　膀胱癌nm23－H1基因RT－PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，M：marker(PBR322/HinfⅠ)，T：膀胱癌组织，N：非癌对照膀胱粘膜组织

　　2.2　在全部癌和非癌组织中均有nm23－H1基因mRNA的表达。以β₂－微球蛋白作内参照，发现88％的膀胱癌组织出现nm23－H1基因mRNA的高表达(±s=1.42±0.36)，而对照粘膜组织中低水平表达(±s=0.63±0.33)，差别具有显著性(P＜0.05)。这种表达的差异性在以自身为对照的配对资料中更为显著(图2)。nm23－H1基因mRNA的相对表达量随着病理分级、临床分期的增高有上升趋势，但差异无 显著性。

图2　膀胱癌组织nm23－H1基因银染SSCP分析结果，

　　1：非癌对照膀胱粘膜DNA，2－10：膀胱癌组织DNA，

　　3，4，9可见异常单链泳动带

　　3　讨论

　　转移抑制基因nm23是Steeg从转移潜力不同的鼠黑色素瘤细胞系中分离出来的。其中nm23－H1亚型与肿瘤转移的关系更为密切。在乳腺癌、胃癌、结肠癌中nm23－H1基因的缺失或低表达与其转移密切相关^[1]。然而随着研究的深入，在某些肿瘤中也得到了相反的结论^[2]，支持和不支持其作为转移抑制基因的观点尚有争论。

　　本组研究显示，在88％(22/25)的肿瘤组织中nm23－H1mRNA的表达水平明显高于正常对照组(P＜0.05)。这种表达的差异在来自同一患者的肿瘤标本及癌旁对照组织的配对资料中更为显著。将肿瘤标本按病理分级、临床分期进行分组观察nm23－H1mRNA的表达情况，发现随着肿瘤浸润程度的增加，nm23－H1mRNA的表达呈上升趋势，但尚不具备统计学意义。提示nm23－H1基因的高表达可能与膀胱癌恶性表型的出现及恶性进展有关。Kanayama^[3]和 fujii^[4]也得出类似结论，他们认为：在膀胱癌中nm23－H1基因不是转移指标，而可能是肿瘤局部浸润的指标。 研究认为nm23基因可能通过丝氨酸磷酸化过程调节细胞增殖。Shinna等^[5]用免疫组化方法检测nm23－H1蛋白在人膀胱癌中的表达情况，发现其蛋白在膀胱癌中表达增强且与增殖性核 抗原(PCNA)的表达呈正相关，在浸润性组织中nm23－H1蛋白的表达强于表浅性肿瘤，该结果与本研究结果存在一致性。nm23基因在肿瘤发生和转移中的作用尚未 明确，Okabe－kado等[6]的研究表明，nm23蛋白是白血病细胞分化的抑制蛋白，我们可以推测如果在膀胱癌中 nm23蛋白具有类似的功能，那么nm23－H1基因在分化良好的移行细胞中低水平表达也是可能的。

　　本研究结果证实，在膀胱癌中存在nm23－H1基因的突变，突变型标本的SSCP条带除异常泳动带外，均具有与非癌对照标本相同的泳动带，提示在膀胱肿瘤中 nm23－H1基因的突变是杂合性的。在6例SSCP阳性标本中，1例为多发性膀胱癌；1例为复发性膀胱肿瘤。基因突变与膀胱肿瘤生物学行为的关系还需扩大样本数以及完善随访资料进行深入研究。随着肿瘤恶性度的 增加，nm23－H1基因突变率与其基因相对表达量的升高存在一致性，Haut^[2]在研究直肠癌中nm23－H1基因突变与表达的关系时认为，在直肠癌中由于nm23－H1基因突变而增加了组织中其产物的表达水平，导致不论转移潜能高低，nm23－H1表达均增强。在泌尿系统肿瘤中nm23－ H1基因突变与基因高水平表达的关系究竟是一种偶然的附带现象，还是一种内在的必然联系，有待进一 步研究。

　　nm23基因并非在所有肿瘤中表现转移抑制的功能，目前还不能肯定这是组织特异性的结果。不同的癌细胞在转移潜力上是不同的，同一肿瘤中也只有一个细胞亚群具有转移能力，原发肿瘤中这个细胞亚群的大小随着时间和肿瘤组织学类型的不同而不同。因此，在不同类型的肿瘤中，nm23基因出现的多样性改变是可以理解的。

(范锡凤校对)

　　本文课题受卫生部－吴阶平医学基金和天津市高教委科学基金资助

　　参考文献

　　1，Leone A,Flatow U,King CR,et al.Reduced tumor incidence metastatic potential and cytokine responsiveness of nm23－ transfected melanoma cells. Cell,1991;65： 25～ 35

　　2，Haut M,Steeg PS,Willson JKV,et al. Induction of nm23 gene expression in human colonic neoplasms and equal expression in colon tumors of high and low metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1991;83： 712～ 6

　　3，Kanayama H,Takigawa H,Kagawa S,et al. Analysis of nm23 gene expression in human bladder and renal cancers. J Urol,1993;149： 1089

　　4，Fujii R,Yasui W,Shimamoto F,et al. Immunohistochemistic analysis of nm23 gene product in human bladder carcinomas. Virchows Arch,1995;426(4)： 355～ 9

　　5，Shinna H,Igawa M,Nagani H,et al. Immunohistochemiscal analysis of proliferating cell niclear antigen,P53 protein and nm23 protein in transitional cell carcinoma of bladder. Cancer,1996;78： (8)1762～ 74

　　6，Okabe－ kado J,Kasukabe T,Honma Y,et al. Identity of a differentiation inhibiting factor for mouse myeloid leukemia cells with nm23/nucleoside diphosphate Kinase. Biochem Biophys Res Commun,1992;3： 987～ 94

(1999－05－24收稿)