bcl-2基因表达在人膀胱癌多药耐药现象中的意义

中华泌尿外科杂志 1999年第4期第20卷 论　　著

作者：王祥卫　杨唐俊　何斌　金欢胜　曾毅　刘素英

单位：王祥卫　杨唐俊　何斌　金欢胜　曾毅　刘素英（400037 重庆，第三军医大学附属新桥医院泌尿外科）

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；多药耐药；基因

　　【摘要】　目的　探讨bcl-2基因在人膀胱癌多药耐药中的作用。　方法　应用原位DNA末端转移酶标记法（TUNEL）、免疫细胞化学及逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术，分别对阿霉素诱导的人膀胱癌耐药细胞株(BIU-87/ADM)及敏感细胞株(BIU-87)的细胞凋亡及其bcl-2基因表达进行研究。　结果　（1）在相同条件下，与敏感细胞株相比，耐药细胞株中细胞凋亡明显受到抑制；（2）耐药细胞株中bcl-2基因表达明显强于敏感细胞株。　结论　凋亡抑制基因bcl-2在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达，是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因，对于人膀胱癌多药耐药的产生具有重要意义。

Significance of bcl-2 gene expression in multidrug

　　resistance of human bladder cancer

WANG Xiangwei, YANG Tangjun, HE Bin, et al

　　Department of Urology, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of bcl-2 gene in multidrug resistance in human bladder cancer.　Methods　Expression of bcl-2 gene was analyzed with immunocytochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in BIU-87/ADM and BIU-87 cells.Apoptosis was detected with in situ DNA nick end labeling (TUNEL).　Results　(1)Compared to that of BIU-87 cells,apoptosis of BIU-87/ADM cells was apparently inhibited.(2)Over-expression of bcl-2 gene was found in BIU-87/ADM cells.　Conclusions　The inhibited apoptosis correlated to over-expression of bcl-2 gene contributes to the development of multidrug resistance of human bladder cancer.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Multidrug resistance　　Genes

　　本研究试图从细胞凋亡的角度探讨膀胱癌多药耐药的发生机制。

　　材料和方法

　　一、细胞株及细胞培养

　　人膀胱癌BIU-87细胞株引自北京医科大学泌尿外科研究所。耐药细胞株BIU-87/ADM由我科应用阿霉素大剂量冲击结合低浓度诱导敏感细胞株BIU-87所建立^［1］。细胞置于含5%CO₂、37℃、饱和湿度的孵箱中培养，每3天换培养液一次；细胞融合时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。

　　二、试剂

　　原位DNA末端转移酶标记试剂盒、细胞总RNA提取试剂盒及逆转录-多聚酶链式反应试剂盒均购自德国宝灵曼公司。鼠抗人bcl-2单抗（bcl-2-100）由英国Marson博士惠赠。

　　三、原位DNA末端转移酶标记（TUNEL）^［2］

　　按1×10⁶/ml 细胞密度分别接种BIU-87及BIU-87/ADM细胞于玻片上，24小时后按试验分组分别加入不同浓度的阿霉素（0.1、1.0、10.0mg/L）继续培养24小时（对照组加入无药培养液）；另外设1.0mg/L阿霉素组分别于阿霉素作用的2、12、24、48小时，应用TUNEL试剂盒检测。阳性细胞为胞核呈棕黄色，不着色为阴性。同时应用PBS代替DNA末端转移酶，作为阴性对照。细胞凋亡指数(AI）：每张玻片选取5个视野（×400），计数500个细胞，求得阳性百分率。

　　四、bcl-2蛋白表达的检测

　　ABC法。阳性细胞胞浆呈棕黄色，不着色者为阴性。同时应用PBS代替一抗，作为阴性对照。

　　五、逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）

　　1.细胞总RNA的提取参照试剂盒说明进行。紫外分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA质量。

　　2.RT-PCR按参考文献［3］方法进行。取15μl PCR产物进行电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.5%。紫外灯下观察、照像。

　　六、统计方法

　　所有数据以±s表示；用t检验进行两个样本率的比较。

　　结　　果

　　一、细胞凋亡指数（AI）见图1，2

　　图1显示BIU-87及BIU-87/ADM细胞在不同浓度的阿霉素作用24小时后，所诱导的AI随阿霉素药物浓度的增加而增高，仅在阿霉素浓度为0.1及1.0mg/L时，两者AI差异有显著性（P＜0.01）。图2显示1.0mg/L阿霉素分别作用于BIU-87及BIU-87/ADM细胞不同时间所诱导的AI。随作用时间延长，AI明显增高；两组细胞的AI在阿霉素作用的2、12、24小时差异有显著性（P＜0.05）。

　　二、bcl-2蛋白的表达　　BIU-87及BIU-87/ADM细胞均有bcl-2蛋白的表达；BIU-87/ADM细胞bcl-2蛋白表达强阳性（++），而BIU-87细胞bcl-2蛋白表达呈弱阳性（+）。

　　三、bcl-2 mRNA的表达

　　BIU-87/ADM及BIU-87细胞均出现459bp（bcl-2）及587bp（β-actin）的特异性扩增片段，内参照β-actin 显示上样量均等。bcl-2扩增条带亮度出现明显差异，以BIU-87/ADM细胞为明显（图3）。

　　讨　　论　　许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的^［4］。细胞凋亡主要表现为形态学变化及DNA的断裂。前者包括胞浆固缩、体积变小、胞核致密以及形成凋亡小体；后者主要是由于细胞内核酸内切酶的激活，在核小体之间切断DNA，形成大量200bp倍数的DNA断片，电泳可出现梯形改变^［5］。原位DNA末端转移酶标记法定位准确，亦可定量检测凋亡细胞，尤其是对早期凋亡细胞的检测敏感性强，结合细胞的形态学变化，特异性较强。本研究结果发现：阿霉素诱导的BIU-87及BIU-87/ADM阳性细胞（凋亡细胞）胞核黄染，核固缩，胞浆不着色，提示阿霉素是通过激活核酸内切酶诱导细胞凋亡。核酸内切酶的激活将基因组DNA降解为带有5＇-磷酸基（5′-P）和3′-羟基（3′-OH）末端的片断，原位DNA末端转移酶标记法可将FITC标记的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）掺入到早期凋亡细胞的DNA断片的3′-羟基（3＇-OH）末端，从而检测到凋亡细胞。因此，TUNEL法所检测到的DNA降解片断反映了阿霉素诱导的人膀胱癌细胞凋亡的早期改变，结果还发现BIU-87/ADM细胞AI明显低于BIU-87细胞，提示细胞凋亡在耐药细胞株BIU-87/ADM中明显受到抑制。由此可见：虽然阿霉素可诱导BIU-87及BIU-87/ADM细胞凋亡，但两者对细胞凋亡的敏感性存在着明显差异。由于BIU-87/ADM细胞的多药耐药性是应用阿霉素逐步诱导BIU-87细胞形成的^［1］，提示BIU-87/ADM细胞多药耐药现象的形成过程可能是细胞凋亡逐步受到抑制的过程。

　　bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因，是决定肿瘤预后的重要指标，该基因表达增强能显著抑制细胞凋亡^［6］。将该基因转入对化疗敏感的淋巴瘤细胞能产生抗药性^［7］。说明bcl-2基因表达增强与MDR形成密切相关。本研究结果显示：BIU-87/ADM细胞bcl-2蛋白表达强阳性，而BIU-87细胞呈弱阳性。同时以β-actin作为内参照，应用RT-PCR检测bcl-2 mRNA的表达结果表明: 内参照β-actin 表达量均等，bcl-2 mRNA在耐药细胞BIU-87/ADM中表达明显高于敏感细胞BIU-87。因此，bcl-2基因在耐药细胞BIU-87/ADM中的高表达是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因。bcl-2基因可能通过以下途径参与人膀胱癌细胞多药耐药的产生：在应用阿霉素诱导BIU-87/ADM细胞多药耐药形成过程中，最初呈bcl-2低表达的细胞出现明显凋亡，随着诱导期延长，该细胞株的bcl-2 基因表达逐步增强，阻止或减少了细胞凋亡的发生，从而产生多药耐药现象。因此，bcl-2基因表达状况不仅可以作为判断肿瘤细胞有无多药耐药现象发生的一个客观指标，而且在进一步探索如何降低bcl-2基因表达，诱导细胞凋亡，从而克服多药耐药方面同样具有重要价值。

　　参考文献

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(收稿：1998-06-08　修回：1998-11-16)