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人前列腺癌cDNA文库的构建

人前列腺癌cDNA文库的构建

周利群　颍川晋　高垣洋太郎　初濑洋美　小柴健

　　那彦群　潘柏年　薛兆英　顾方六　郭应禄

　　【摘要】　目的　采用高效互补DNA(cDNA)合成技术构建人前列腺癌的cDNA文库。

　　 方法　从前列腺癌患者的经尿道电切标本中提取总RNA，纯化后得到Poly(A)+RNA；依次合成单链及双链cDNA；经纯化后与衔接头相连接；再与噬菌体载体λgt 10臂相连接，于体外包装后建成cDNA文库；以大肠杆菌C600hfl-行滴度测试及扩增。

　　 结果　构建的人前列腺癌cDNA文库含2.76×108重组子，克隆效率为3.19×1014重组子/g cDNA。扩增后的文库浓度为4.4×107重组子/μl，将文库稀释至10-7时所产生的噬菌斑密度最为适宜。

　　 结论　所构建的人前列腺癌高效cDNA文库为进一步筛选克隆前列腺癌的特异性癌基因或抗癌基因奠定了基础。

　　【关键词】　前列腺肿瘤 癌 互补脱氧核糖核酸 文库

Construction of a cDNA library of human prostate carcinoma

　　

ZHOU Liqun,Shin Egawa,Yohtaroh Takagaki,et al.

The Institute of Urology,Beijing Medical University,Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To construct a cDNA library of human prostatic carcinoma with highly effective techniques of cDNA synthesis.　Methods　Total RNA of prostate carcinoma was extracted from the transurethral resection specimen of a patient and then poly (A)+ RNA was extracted further.Moreover,single-strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn.After purified,double-strand cDNAs were ligated to the specific linker,then with arms of the bacteriophage λgt 10 and further packaged in vitro to set up the cDNA library.Titering and amplification of the library was carried out with the E.Coli strain C600 hfl-.　Results　The titering showed that the library contatined 2.76×108 recombinants and the cloning efficiency was 3.19×1014 recombinants/g cDNA.The amplified library was 4.4×107 recombinants /μl in concentration and the number of bacteriophage plagues was the most suitable in density after it was diluted to 10-7 in concentration.　Conclusions　The constructed cDNA library of human prostate carcinoma is a highly efficient one and lays solid foundation for screening and cloning specific oncogenes or tumor suppressor genes of prostate carcinoma.

　　【Key words】　Prostate neoplasms　　Carcinoma　　Complementary DNA　　Library

　　从前列腺癌患者的经尿道电切标本中提取总RNA，再通过高效的cDNA合成技术构建人前列腺癌的cDNA文库，为进一步开展前列腺癌分子病因学的研究奠定基础。

　　材料和方法

　　一、前列腺癌标本的获得

　　62岁男性患者，经前列腺穿刺活检证实为前列腺腺癌，Gleason评分为7分(4+3)，骨扫描示有多发骨转移，B超及CT示盆腔多处淋巴结转移，分期为D2，T4N1M1。经LHRH激动剂(Zoladex)治疗1年后症状恶化，行姑息性经尿道电切及双侧睾丸切除术。切除之组织块立即以液氮处理，-80℃冻存。

　　二、生化试剂

　　Isogen试剂及OligotexTM-dT30试剂盒为罗氏株式会社产品,Oligo-dT18，RNA酶抑制剂(RNasin),莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶，RNA酶H，大肠杆菌DNA多聚酶Ⅰ，T4 DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，λgt 10去磷酸化臂，噬菌体体外包装系统，Biogel A50m层析柱，菌株C600hfl-，显色剂和诱导剂IPTG及X-gal，α-32 P-dNTP，衔接头STP025/026(5′端已磷酸化，含EcoR I位点)，均为日本Takara株式会社产品。

　　三、前列腺癌总RNA的提取及Poly(A)+RNA的提取

　　前列腺癌总RNA的提取按Chomczynski等［1］的一步法，以Isogen试剂进行提取。Poly(A)+RNA的纯化以Oligotex TM　-dT30试剂盒进行提取，按产品说明书进行。

　　四、单链cDNA(sscDNA)的合成及鉴定

　　sscDNA的合成按Gubler等［2］的方法进行。反应总体积为20μl。分别于反应开始前后取0.5μl反应液，滴于聚乙烯胺纤维素板上，行薄层层析后将层析原点和头切下后行Cerenkov同位素计数，以计算sscDNA的产量。

　　五、双链cDNA(dscDNA)的合成及鉴定

　　dscDNA的合成仍按Gubler等［2］的方法进行。反应总体积为100μl，于反应前后各取1.0μl反应液滴于PEI板上以行薄层层析计算其产量。随后对dscDNA行苯酚/氯仿提纯及酒精沉淀。

　　六、dscDNA重组及两端连有衔接头的dscDNA分离提纯

　　在T4 DNA连接酶作用下，将dscDNA与衔接头STP025/026相连接，总反应体积为5μl，于16℃水浴下过夜。然后取0.5μl于0.75%琼脂糖凝胶电泳鉴定。随后将重组产物层析分离，得到两端连有衔接头的dscDNA，按文献［3］方法进行纯化。

　　七、cDNA文库的构建

　　在T4DNA连接酶作用下，按摩尔数比λgt 10臂：两端连有衔接头的dscDNA=2∶1的比例建立反应体系，总反应体积为2.5μl。16℃水浴过夜后，置于冰浴内，复加入T4DNA连接酶0.25μl(2 Weiss单位)，冰浴2小时。随后65℃水浴灭活连接酶，将其与Max PlaxTM噬菌体体外包装提取物混合振荡后22℃下置放2小时，加入500μl SM缓冲液后4℃保存。

　　八、cDNA文库的滴度测试及扩增

　　按Sambrook等［4］的方法制备C 600hfl-饥饿菌株。分别计数清亮噬菌斑数,计算文库滴度。文库的扩增按Sambrook等［5］的方法进行。

　　结　　果

　　一、RNA定性及定量分析

　　经紫外分光检测共提取总RNA 4 042μg，吸光度A260/吸光度A280＞1.8。甲醛变性凝胶电泳检测表明28SRNA∶18S RNA＞2∶1(图1)，证实所提的RNA未出现降解，其相对分子质量分布正常。

图1　总RNA甲醛变性凝胶电泳分析结果显示：28S rNA∶18S RNA＞2∶1

　　二、Poly(A)+RNA的纯化

　　紫外分光光度法检测表明共提取Poly(A)+RNA 41.04μg，占总RNA的1.02%，与其在总RNA中所占比值相符。其吸光度A260/吸光度A280＞1.8，经甲醛变性凝胶电泳检测表明所提Poly(A)+RNA未发生降解，未见总RNA中很强的28S及18S条带(图1)。

　　三、sscDNA和dscDNA合成的薄层层析结果及合成量

　　sscDNA和dscDNA合成的薄层层析结果见图2，Cerenkov同位素计数结果见表1。计算结果显示，sscDNA的合成率为3.85%，合成量为1.112μg,dscDNA的合成率为8.90%，合成量为2.972μg。

表1　sscDNA和dscDNA合成的薄层层析结果行Cerenkov同位素计数后结果

　　(已减去各管基数值)

Cerenkov计数

Cerenkov计数

原点1　　　　516

头点1’　　　98 609

原点2　　　2 896

头点2’　　　75 230

原点3　　　8 088

头点3’　　　90 889

　　图2　sscDNA和dscDNA合成的薄层层析结果：点1、2、3分别为sscDNA合成前后及dscDNA合成后反应液的原点，1挕?/FONT＞2挕?/FONT＞3挿直鹞阄龊蟮耐返?/FONT＞
　　四、dscDNA两端与衔接头的连接

　　将连接反应液于0.75%琼脂糖凝胶上行电泳后，将凝胶于40℃负压下烘干后行放射自显影。显示dscDNA呈均匀分布，长度在500～10 000bp之间。经柱状层析分离dscDNA-衔接头复合物后纯化，依据其沉淀物行Cerenkov同位素计数的结果，经计算dscDNA-衔接头复合物的量为237ng，按dscDNA的平均长度为1 500bp计算，其相对分子质量约为1×106，其摩尔数为237fmoles。

　　五、cDNA文库扩增前后的滴度测试结果

　　经以C 600hfl-菌株行滴度测试显示，形成的噬菌斑均为透明型，即重组体，几未见蓝色噬菌斑，即野生型。以噬菌体效价代表文库大小，按公式：重组子数(白色噬菌斑数×稀释倍数×包装反应总体积)结果显示所构建的人前列腺癌cDNA文库含2.76×108重组子，克隆效率相当于3.19×1014重组子/g cDNA。经以C 600hfl-菌株扩增后，滴度测定结果显示扩增后文库的浓度为4.4×107重组子/μl,将文库浓度稀释至10-7时所产生的噬菌斑密度最为适宜。

　　讨　　论

　　目前，国外有关前列腺癌分子病因学研究已成为泌尿外科应用基础研究的一个热点，前沿课题的研究方法多采用分子生物学DNA重组及克隆技术，建立起cDNA文库，然后对其进行筛选、鉴别，并克隆特异性的cDNA片段，以寻找组织特异性的基因。目前这方面的研究已取得了一定进展。文献报道，前列腺癌存在某些基因突变如p53基因，某些基因表达丧失和等位基因缺失如DCC基因，某些癌基因如PCTA-1，PTI-1，以及某些抗癌基因如KAⅠ1，但这些变化均非前列腺癌的特异性改变［6，7］。

　　自1976年Efstratiadis等［8］及Rougeon等［9］分别报道成功地进行了cDNA的分子克隆，至今cDNA文库已有20余年的历史，并已发展成为分子生物学研究的一个极为重要的有效试验方法，而且技术日臻完善，应用日渐广泛。cDNA文库的作用包括：(1)寻找决定生长、分化、癌变等过程的基因，包括癌基因和抗癌基因等。在对个体的生长发育、细胞分化及细胞恶变等重要过程的研究中，常需从比较不同组织间、正常组织与异常组织间、同一组织或细胞在不同发育时期基因表达的差别入手。通过筛选、克隆、测序有差异的cDNA，与现有的基因库相比较，以期发现新的基因。很多肿瘤的癌基因和抗癌基因均是通过cDNA文库的筛选而分离出来的。(2)分离已知的基因：从文库中筛选出的基因可直接在大肠杆菌这类原核生物中表达，易于分析和制备；筛选出的基因测序后，可推测出其编码的蛋白质的氨基酸顺序，可阐明基因及其产物的结构和功能及对肿瘤发生、发展的影响。(3)揭示某些因素对基因表达的影响：致癌物、激素、药物、金属离子等均可引起机体、组织或细胞的变化，而且常是在基因表达水平上的变化。cDNA文库为发现这些变化提供了有效的方法，从而可在理论上阐明这些因素对细胞的影响及作用机制。目前国外已建成多种肿瘤组织来源的cDNA文库［10］，前列腺癌的cDNA文库的构建和筛选已有文献报道，但数量并不多。国内已有胃、结肠、肝脏、食道等肿瘤的cDNA文库建成［11］，但尚无前列腺癌等泌尿生殖系统肿瘤cDNA文库的建立及应用的报道。

　　本研究利用DNA重组及分子克隆技术，构建了高效率的人前列腺癌cDNA文库。经滴度测定该文库含2.76×108重组子，克隆效率相当于3.19×1014重组子/g cDNA，经以C 600hfl-菌株扩增后，其浓度达到了4.4×107重组子/μl。此文库为cDNA克隆工作奠定了坚实的基础。可以使用mRNA差异显示技术寻找、克隆前列腺癌特异性的cDNAs；以此为探针，对该cDNA文库进行筛选，分离、测序完整的特异cDNA克隆，以期寻找前列腺癌特异性或表达有差异的癌基因或抗癌基因，为前列腺癌的早期诊断、早期治疗、预防及晚期肿瘤的治疗探索新的途径。

　　本课题受国家自然科学基金项目(39800173)及国家教委留学回国人员科研启动基金资助

　　作者单位：周利群　那彦群　潘柏年　薛兆英　顾方六　郭应禄（100034 北京医科大学第一临床医学院，北京医科大学泌尿外科研究所）

　　颍川晋　小柴健（日本北里大学医学部泌尿器科）

　　高垣洋太郎　初濑洋美（分子生物学系）

　　参考文献

　　[1]　Chomczyski P,Sacchi N.Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,162∶156-159.

　　[2]　Gubler U,Hoffman BJ.A simple and very efficient method for ge-nerating cDNA libraries.Gene,1983,25∶263-269.

　　[3]　Shapiro DJ.Quantitive ethanol precipitation of nanogram quantities of DNA and RNA.Analytical Biochemistry,1981,110∶229-231.

　　[4]　Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,et al.λ噬菌体的培养、纯化和DNA提取.见：Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T 著.金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆-试验指南(中译本).第2版.北京：科学出版社，1992，127-138.

　　[5]　Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,et al.cDNA 文库的扩增.Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T 著.金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆-试验指南(中译本).第2版.北京：科学出版社，1992，448-449.

　　[6]　Shen RQ,Su ZZ,Olsson CA,et al.Identification of the human prostatic carcinoma oncogene PTI-1 by rapid expression cloning and differential RNA display.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92∶6778-6782.

　　[7]　Dong JT,Lamb PW,Rinker-Schaeffer,et al.KAI 1,a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2.Science,1995,268∶884-886.

　　[8]　Efstratiadis A,Kafatos FC,Maxam AM,et al.Enzymatic in vitro synthesis of globin genes.Cell,1976,7∶279-288.

　　[9]　Rougeon F,Mach B.Stepwise biosynthesis in vitro of globin genes from globin mRNA by DNA polymerase of avian myeloblastosis virus.Proc Natl Acad Sci USA,1976,73∶3418-3422.

　　[10]　Campbell T,Skilton RA,Coombes RC,et al.Isolation of a lactoferrin cDNA clones and its expression in human breast cancer.Br J Cancer,1992,65∶19-26.

　　[11]　沙家豪，周作民，胡志刚，等.人睾丸cDNA文库的构建.男性学杂志，1993，7∶139-141.

(收稿：1998-06-27　修回：1998-11-24)
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