应用间期FISH技术探讨cyclinD1基因在鼻咽癌中的扩增

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癌症 2000年第1期第19卷基础研究

作者：黄贻学　方嬿　郭颖　郝亚萍　李辉梅　曾益新

单位：黄贻学　方嬿　郭颖　郝亚萍　李辉梅　曾益新（中山医科大学肿瘤研究所，广东广州510060）

关键词：鼻咽肿瘤；间期荧光原位杂交（FISH）；细胞周期蛋白D1(cyclinD1)基因扩增

　　摘　要：目的：检测cyclinD1基因在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）细胞中的扩增情况，探讨cyclinD1基因在NPC发生及发展中的作用。方法：应用间期MicroFISH技术。结果：83例NPC病例可见23例（占27.71％）出现cyclinD1扩增；其中Ⅰ、Ⅱ期病例扩增的有5例，Ⅲ、Ⅳ期病例扩增的有18例；23例扩增中16例（69.56％）伴有颈淋巴结转移。结论：cyclinD1扩增与NPC的中晚期发展可能有一定关系，并与颈淋巴结转移呈正相关。

　　分类号：R739.6　文献标识码：A

　　文章编号：1000－467X(2000)01－0020－03

Cyclin D1 gene amplification in the primary nasopharyngeal

　　carcinoma by interphase FISH

HUANG Yi-xue， FANG Yan， GUO Ying， et al.

　　Cancer Research Institute, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,

　　Guangzhou 510060, P.R. China

　　Abstract：Objective：To detect the amplification of the cyclin D1 in the primary nasopharyngeal carcinoma cells， and study its relation to the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods：The interphase micro-fluorescence in situ hybridization was used.Results： Amplification of cyclin D1 was found in 23 of 83 cases NPC (about 27.71％ )； 5 of which were stage Ⅰ and Ⅱ , 18 of which were stage Ⅲ and Ⅳ 16 of which were found with cervical lymphadenopathy (69.56％ ). Conclusions： Amplification of cyclin D1 may be associated with the development of NPC， and it may be positively correlated with cervical lymph node metastasis.

　　Key words： Nasopharyngeal neoplasms; Interphase fluorescence in situ hybridization; Cyclin D1 gene amplification ▲

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南方发病率较高的恶性肿瘤，既往对NPC的病因发病学进行了大量研究，然而对它的确切分子机制仍不太清楚。近年来分子遗传学研究结果表明，NPC同其他肿瘤一样，是一多基因参与、多步骤、多阶段的过程^[1]。在细胞恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期调控因子也参与癌变的调节；细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在细胞周期的G₁期调控起重要作用，cyclin D1基因扩增和表达异常可以促进G₁/S期转换而加速细胞周期进程。

　　CyclinD1基因定位在染色体11q13上。细胞遗传学研究资料显示，头颈部、肺和食道鳞癌10％～50％有11q13扩增^[2]。Hui^[3]等研究报道乳腺癌11q13扩增与雌激素受体阳性呈正相关。近年郭颖^[4]等报道用CGH方法检测NPC染色体DNA拷贝数变化，发现NPC细胞存在有11q13扩增和11q13杂合缺失现象。为了探讨cyclin D1在NPC发生发展中可能发生的作用，本研究应用间期MicroFISH技术检测了NPC细胞间期核中cyclin D1的变化。

　　间期Micro-FISH技术是在间期FISH基础上改进的一项新的细胞分子生物学技术，具有探针稳定、操作安全、一次检测多个病例（至少21例）等优点，且将细胞形态和分子生物学相结合，是目前研究肿瘤分子机理和临床应用的有力工具。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　本组41例经病理确诊为鼻咽癌而未经治疗的活检组织取自中山医科大学肿瘤医院门诊患者，其中男27例，女14例；年龄最大79岁，最小29岁。临床分期（按鼻咽癌92分期）：Ⅰ、Ⅱ期5例，Ⅲ、Ⅳ期36例。另外42例鼻咽癌组织取自本院病理科存档的蜡块组织，其中男35例，女7例；年龄18岁～93岁，临床分期均属Ⅰ、Ⅱ期病例。

　　1.2细胞悬液的制备

　　41例活检组织用常规方法制备单个细胞悬液；另42例蜡块组织根据Hedley^[5]等石蜡包埋组织单细胞悬液制备技术，每例组织连续切取6μm厚的组织片6～10片；经二甲苯脱蜡、酒精脱水、蛋白酶k消化，获得单细胞悬液。在杂交前2～4天，将单细胞悬液滴在经处理过玻片上，（每玻片上点滴21例细胞悬液），自然风干备用。

　　1.3探针的制备

　　CyclinD1探针购自Vysis公司（Fluoro-phore直接标记，呈红色）。

　　1.4间期荧光原位杂交检测方法

　　常规细胞制片2～6天，玻片用100μlRNA酶（100μg/ml）37℃消化1小时，于70％甲酰胺2×SSC中73℃±1℃变性5分钟后经酒精脱水，风干；同时将探针混合液（Lysis杂交Buffer7μl，探针1μl，2μl纯净水）置73℃±1℃水浴箱内变性5分钟，然后将变性探针混合液加于变性的细胞玻片上，盖上盖玻片，并以封口胶封闭，置37℃温箱杂交过夜。次日将盖玻片取下，放入45℃50％2×SSC甲酰胺内10分钟共3次，然后再放入2×SSC液中洗10分钟，最后在室温放入2×SSC/0.1％NP40洗5分钟，后放入2×SSC/0.1％NP40内洗1分钟（室温）凉干，加DAPI补染，即可在荧光显微镜下观看结果。

　　1.5试验结果分析标准

　　在荧光显微镜油镜下，选取分散较好、形态完整的肿瘤细胞作分析，观察细胞核内荧光杂交信号并计数。每例计数50～200个细胞核。判断标准：有两个红色杂交信号者为正常，出现2个以上杂交信号者为扩增^[6]，仅见1个红色杂交信号者则为杂合性缺失；片中浸润肿瘤组织内的淋巴细胞或间质细胞出现两个杂交信号者为内参照。

　　1.6统计方法

　　Chi-Square(χ²)检验。

　　2结果

　　应用间期Micro-FISH技术检测83例NPC细胞间期核中cyclin D1的变化，结果发现23例存在cyclin D1扩增，在扩增病例的间期核内可见多个形态一致的、清晰的红色杂交信号，为4个以上不等（图3、图4）；另有5例NPC间期细胞核内仅见一个清晰的杂交信号（见图2）；其余55例间期核内均见两个杂交信号。在出现cyclin D1扩增的病例中有5例属于临床Ⅰ、Ⅱ期病人，有18例属于Ⅲ、Ⅳ期病人（见表1）。

图1　箭头所示在DAPI背景下肿瘤细胞，其他是淋巴细胞，100×

图2　箭头显示在荧光下图1肿瘤细胞中仅见一个杂交信号，淋巴细胞两个杂交信号，100×

图3和图4显示肿瘤细胞内有多个不等杂交信号而正常淋巴细胞仅见两个杂交信号，100×

表1cyclin D1扩增与临床分期关系

临床分期	n	cyclin D1扩增	cyclin D1缺失
Ⅰ、Ⅱ	47	5(10.64％)	5(10.64％)
Ⅲ、Ⅳ	36	18(50.00％)
合计	83	23(27.71％)	5(6.02％)

　　经统计学分析cyclin D1扩增在Ⅰ、Ⅱ期病例与Ⅲ、Ⅳ期病例间两者有显著性差异（P＜0.01）这表明cyclin D1扩增在NPC早期不明显而在中晚期病人中则多见。

　　此外，在23例cyclin D1扩增中有16例出现颈淋巴结转移（占69.56％），而60例无cyclin D1扩增中只有18例出现颈淋巴结转移（占30％），经统计学分析两者之差也有统计学意义(P＜0.01）。3讨论

　　近年研究表明在细胞恶性转化过程中，除癌基因/抑癌基因的正负调节失控外，细胞周期调控因子也是参与癌变过程的调节位点。已知细胞周期蛋白cyclin D1在细胞周期的G₁期调控中起重要作用，它与肿瘤的生长、恶化和转移有密切关系。

　　本实验发现NPC细胞存在cyclin D1扩增（见表1），结果与TroyCallende^[7]等报道的cyclin D1在头颈部肿瘤扩增达30％的结果基本相似。此外，结合临床资料分析，Ⅰ、Ⅱ期病例组出现cyclin D1扩增率明显低于Ⅲ、Ⅳ期病例组（10.64％和50％）（P＜0.01），这支持cyclin D1扩增是属于NPC的晚发事件。cyclin D1扩增组病例出现颈淋巴结转移率明显高于无cyclin D1扩增组（69.56％和30％）（P＜0.01），提示cyclin D1扩增与NPC的颈淋巴结转移呈正相关，而且cyclin D1扩增的病例具有肿瘤转移的特点。

　　CyclinD1是细胞周期G₁→S关键限速点的重要调节因子之一。在正常情况下，在G₁期cyclin D1与CDK4/CDK6结合，使RB蛋白磷酸化释放E2F转录因子促进细胞进入S期。当cyclin D1扩增时，G₁→S期缩短，从而促进细胞增殖。基因扩增是基因不稳定性的重要标志，也是激活癌基因的重要方式之一，在肿瘤细胞中自发基因扩增的频率很高。

　　目前，发现定位于11q13的基因除cyclin D1基因外，还有已被公认的抑癌基因MEN1。研究资料^[8]表明11q13的杂合性缺失伴有MEN1基因的突变或杂合性缺失可见于甲状腺肿瘤、散发性胰腺肿瘤、垂体腺瘤等。Hui^[9]等曾在NPC活检组织进行微卫星序列分析时发现染色体缺失部位集中在11q13.22和11q22.24；郭颖（待发表）等应用微切割方法研究NPC的11q13杂合性缺失，提示位于11q13的MEN1基因的缺失可能和NPC的发病有关。本实验发现47例Ⅰ、Ⅱ期NPC病例中5例出现cyclin D1缺失，推测早期NPC可能与11q13的杂合性缺失、抑癌基因MEN1的失活有关。

　　Jares^[10]发现cyclin D1在部分喉癌（37％）扩增了2～12倍，并与肿瘤浸润，淋巴结转移，肿瘤分期等病理参数显著相关，这部分肿瘤愈后不良。其他如头颈、乳腺、食道等恶性肿瘤也有类似报道。Jares还发现cyclin D1的mRNA过表达未见其扩增现象，说明基因扩增不是导致过表达的普遍机制。染色体易位、基因调控区突变以及mRNA稳定性改变都可能激活cyclin D1过表达；反之，也有报道^[10]cyclin D1扩增并不伴有其mRNA的过表达情况，提示11q13扩增区还有其他癌基因参与肿瘤的发展。由此可见，在对肿瘤中的作用机制中cyclin D1基因除扩增方式外还可能与其相邻的其他癌基因协同作用于细胞恶性转化，促使肿瘤的发展和转移。然而cyclin D1基因在NPC中与其相邻的基因协调作用的机制更有待深入研究。

　　基金项目：本课题受中山医科大学“211工程”重点学科建设资助项目资助

　　通讯作者：Tel：86－20－87331887

　　E-mail：zfh99@163.net

　　参考文献：

　　［1］Fearon.ER, Vogelsein-B. A genetic model for colorectal tumorigenesis［J］. Cell,1990,61(5)： 759～ 776.

　　［2］Leonard JH, Kearsley JH, Chenevix-Trench G, et al. Analysis of gene amplification in head-and-neck squamus-cell carcinomas［J］. Int J Cancer,1991,48： 511～ 515.

　　［3］Hui R, Cornish AL, McCLelland RA,et al. cyclin D1 and estrogen receptor messenger RNA levels are positively correlated in primary breast cancer［J］. Clin cancer Res, 1996, 2(6)： 923～ 928.

　　［4］郭颖,方嬿,梁启万,等. 47例NPC遗传变异的研究[J］.癌症,1999,18(1)：5～8.

　　［5］Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded patho-logical material using flow cytometry［J］. J Histochem Cytochem, 1983, 31(11)： 1333～ 1335.

　　［6］Matsumura K, Kallioniemi A,Kallioniemi O, et al. Deletion of chromosome 17p loci in breast cancer cells detected by fluorescence in situ hybridization［J］. Cancer Res, 1992, 52(12)： 3474～ 3477.

　　［7］Callerder T,el-Naggar AK,Lee MS, et al. PRAD-1(CCND1)/cyclin D1 oncogene amplification in primary head and neck squamous cell carcinoma［J］. Cancer,1994,74(1)： 152～ 158.

　　［8］Eubanks PJ,Sawicki MP,Samara GJ,et al.Pancreatic endocrine tumors with loss of heterozygosity at the multiple endocrine neoplasia type Ⅰ locus［J］. Am J Surg, 1997,173(6)： 518～ 520.

　　［9］Hui AB, Lo KW, Leung SF, et al. Loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 11 in nasopharyngeal carcinoma［J］. Cancer research,1996,56： 3225～ 3229.

　　［10］ Jares P, Fernandez PL, Campo E, et al. PRAD-1/cyclin D1 gene amplification correlates with messenger RNA overexpression and tumor progression in human laryngeal carcinomas［J］. Cancer Res,1994,54(17)： 4813～ 4817.

收稿日期：1999－10－21

修回日期：1999－11－01

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