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鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较

鼻咽癌组织中EB病毒的不同原位检测方法比较

癌症 2000年第1期第19卷 基础研究

作者:许亮国 姚开泰 谢鹭 周文 杨玉文 陈曲侯 王睤章

单位:许亮国  姚开泰 谢鹭 周文 杨玉文(湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室,湖南长沙410078);陈曲侯 王睤章(中山大学生命科学院,广东广州510275)

关键词:原位杂交;原位PCR;EBER-1;EB病毒

  摘 要:目的:探讨在鼻咽癌组织石蜡切片标本中原位检测EB病毒的更快速、更灵敏的方法。方法:用地高辛标记的寡核苷酸EBER-1和EBVDNA的BamHI-W片段为探针,分别用原位杂交、原位PCR检测鼻咽癌组织切片中EBV的分布情况。结果:用寡核苷酸EBER-1作探针原位杂交检测EB病毒的方法比用BamHI-W片段作探针原位杂交及原位PCR的方法更灵敏、更简单。结论:用EBER-1作探针原位杂交检测鼻咽癌组织切片中EB病毒的方法不失为一种简单、快速、灵敏的方法。

  分类号:R73;R739.63 文献标识码:A

  文章编号:1000-467X(2000)01-0031-03

Comparison of different methods for in situ detection of

  Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma

XU Liang-guo

  (Key Laboratory of Carcinogenesis Mechanism of Ministry of Health, Hunan Medical University,Changsha 410078,P.R.China)

  (School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)

  YAO Kai-tai1, XIE Lu1, et al.

  (School of Life Science, Zhongshan University,Guangzhou 510275,P.R.China)

  Abstract:Objective:To investigate a rapid, sensitive non isotopic method for in situ detection of Epstein Barr virus (EBV) in paraffin-embedded section of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues. Methods: The oligo-nucleotide EBER-1 and EBV BamHI-W fragment were labeled with digoxigenin as probes,in situ hybridization and PCR in situ hybridization were performed to detect EBV distribution in NPC tissues. Results:The signal strength of in situ hybridization with EBER-1 oligonucleotide probe was clearly stronger than that of in situ hybridization and PCR in situ hybridization with BamHI-W fragment probe. Conclusion: In situ hybridization with EBER-1 probe to detect EBV in NPC tissues is a sensitive, simple and rapid method.

  Key words:In situ hybridization; In situ PCR; EBER-1; Epstein-Baar virus ▲

  Epstein-Barr病毒(EBV)与鼻咽癌(NPC)具有非常密切的关系[1,2]。各家检测EBV DNA的方法均不完全相同,灵敏度也存在差异[2,3,6,9,11]。原位杂交是比较传统的方法,但很难检测低拷贝数DNA或RNA在细胞内的存在,近几年来用来提高检测灵敏度而出现的原位PCR技术也正在逐步成熟并得到推广[5,8],但对于检测NPC组织中的EB病毒而言,哪种方法更灵敏、更简单,尚未平行比较过。为此,我们将原位PCR技术用来检测EB病毒,并将它与传统的原位杂交技术相比较,以探讨检测NPC组织中EB病毒的相对灵敏、简单的方法。

  1材料和方法

  1.1材料

  鼻咽部活检组织石蜡包埋切片标本由湖南省肿瘤医院病理科提供,共23例,均为近1年内存档标本,按常规福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片(4μm厚),取连续切片标本分别进行原位杂交、原位PCR及常规苏木素伊红(HE)染色。

  1.2方法

  1.2.1原位杂交:EBER-1探针按文献[6]设计,在湖南医科大学肿瘤所合成,按Boehringer Mannheim公司Dig Oligonucleotide3’-End Labeling Kit(Cat.No.1362372)说明书标记。杂交前切片经脱蜡、水化、蛋白酶K处理,每片滴加20μl杂交液(25%甲酰胺,4×SSC,50mmol/LNaH2PO4/Na2HPO4,1mol/LEDTA,5×Denhart's,1mg/mlssDNA,探针浓度为100ng/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片,70℃变性6分钟,37℃杂交过夜。然后用2×SSC,0.1×SSC在室温下各洗脱2次,每次10分钟,去除未杂交信号,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labelingand Detecting Kit(Cat.NO.1093657)进行检测,信号位于胞核中,为紫蓝色沉淀。

  BamHI-W片段由重组pBR322质粒(中科院上海细胞生物所引进)中酶切回收,用Boehringer Mannheim公司Dig DNA Labeling and Detection Kit进行标记,切片标本按前法处理后,每片滴加20μl杂交液(50%甲酰胺,10%硫酸葡聚糖,4×SSC,5×Denhart's,1mg/mlssDNA,探针浓度为1mg/ml),蜡膜覆盖,橡胶水封片。94℃变性8分钟后,42℃杂交过夜。然后用4×SSC,0.1×SSC各洗脱2次,每次10分钟,按前法进行检测。

  1.2.2原位PCR:设计扩增片段长度为241bp,位于EBVDNA中的W片段,引物序列为:引物EW1:5'-TTTGGACCCGAAATCTGA-3'(14007-14024),引物EW2∶5'-GCCCTGACCTTTGGTGA-3(14231-14247),由美国生命技术公司合成。切片经脱蜡、水化、蛋白酶K消化后,每片滴加PCR反应液20μl[50mmol/LKCl,10mmol/LTris.Cl(pH8.3),4.5mmol/LMgCl2,0.1%Triton-X100,200μmol/LeachdNTP,引物浓度为0.5μmol/L,2UnitTaq酶],盖玻片覆盖,指甲油封边。循环条件为:94℃,5分钟变性后,94℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,30个循环,72℃延伸10分钟。PCR反应结束后,去盖玻片,按前述方法用Dig标记的BamHI-W片段作探针原位杂交后进行检测,并设立无探针对照、无引物对照及无EBVDNA的阴性对照。

  2结果

  共比较了23例标本,鼻咽低分化鳞癌16例,慢性鼻咽炎4例,鼻咽部不典型增生3例。其中,3例慢性鼻咽炎各检测方法结果均为EBV阴性;3例不典型增生病例中,2例各方法检测结果均为EBV阴性,另1例W片段探针原位杂交检测结果阴性,但原位PCR和EBER-1原位杂交检测结果阳性;其余16例鼻咽低分化鳞癌标本各检测方法结果均为EBV阳性,只是存在不同检测方法间的信号强度及癌细胞EBV阳性率有差异。对于BamHI-W片段作探针来说原位PCR后杂交信号比单独原位杂交的信号要强,且癌细胞EBV阳性率也要高,说明原位PCR比原位杂交检测方法灵敏度高;但用EBER1作探针行原位杂交后的信号比原位PCR更强,而且细胞轮廓更清晰,见图1~4。

图1显示NPC切片标本中一癌巢(HE×400);

图2显示NPC切片标本中EBV-W片段原位杂交结果(×40);

图3显示NPC切片中EBV-W片段原位PCR结果(×400);

图4显示NPC切片标本中EBER-1原位杂交结果(×400);

1~4均为同一例EBV阳性的鼻咽低分化鳞癌的相邻切片

  3讨论

  90年代以来,出现了将PCR的高效扩增与细胞定位相结合的原位PCR技术[5,7,8],通过原位PCR能将靶片段扩增200~300倍[8],检测灵敏度远远高于原位杂交。原位PCR用于检测外源DNA特别是病毒DNA的报道已有很多[1,4,5,7,8],但用于检测EB病毒的报道并不多[9]。我们成功地运用这一方法检测EB病毒。实验中,选择扩增靶片段长度为241bp,在适当蛋白酶K浓度处理下,并没有出现产物扩散现象;通过设立相邻切片的无探针对照、无Taq酶对照、无引物对照及无EB病毒的阴性标本对照,可以有效地排除假阳性结果;另外,采用的间接法原位PCR所获得的结果也更可靠。

  用非同位素标记寡核苷酸EBER作探针来原位检测NPC组织中的EB病毒,也是近几年来发展起来的方法。用寡核苷酸作探针的检测效果本身并不很敏感,每个分子只能在3'或5'端标记上1个能被检测到的分子,如Dig或Biotin等,一般来说检测灵敏度比其它方法标记的长片段cDNA或DNA作探针差。但就NPC标本来说,EBV转录的EBER拷贝数可高达每个细胞10[6,7,10,11],这就使得用EBER反义寡核酸作探针检测EBV的灵敏度大大提高,甚至超过原位PCR。另外由于EBER探针短,所需的蛋白酶K消化时间短,所以细胞形态也能保持更好。

  基金项目:本课题受国家自然科学基金重点项目资助(No.39730200)

  通讯作者:Tel:86-731-4360094

  Fax:86-731-4360094

  Email:klcarcmh@public.cs.hn.cn

  参考文献:

  [1]Klein G. The Epstein-Barr Vrius[M]. Berlin: Springer, 1979: 339~ 350.

  [2]游绍进,姚开泰,曹亚,等.Epstein-Barr病毒潜伏状态与鼻咽癌的关系[J].中华肿瘤杂志,1996,18(1):23~26.

  [3]蒋晓群,姚开泰.鼻咽及其邻近部位各类型癌组织中EBV DNA的原位检测[J].中华病理学杂志,1994,18(2):85~88.

  [4]Nuovo GJ, Gallery F, Macconnel P, et al. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification[J]. Am J Pathol,1991,139: 1239~ 1244.

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收稿日期:1999-03-10

修回日期:1999-08-28


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