间期FISH在鼻咽癌细胞系及石腊切片中的应用初探

癌症 1999年第4期第18卷 快速报道

作者：谢鹭，周文，许亮国，杨旭宇，姚开泰

单位：湖南医科大学肿瘤研究所(长沙，410078)

关键词：间期；荧光原位杂交；鼻咽肿瘤；石蜡切片

　　【摘要】目的：建立间期荧光原位杂交技术，检测鼻咽癌细胞系和鼻咽癌石蜡切片中9号和3号染色体的数目改变情况。方法：中期染色体片及细胞系滴片制备，间期及石蜡切片荧光原位杂交。结果：9号染色体在鼻咽癌细胞系中为六倍体，在石蜡包埋鼻咽癌组织中也呈多倍体改变。3号染色体在鼻咽癌细胞系中呈三倍体改变，在石蜡包埋鼻咽癌组织中则无非整倍性改变。结论：间期荧光原位杂交为一很有应用前景的技术，可以用于存档石蜡块的研究，考察染色体数目和/或特异基因改变情况，有一定诊断学意义，值得推广应用。

　　中图分类号：R739.6　　文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)04－0364－04

The primary applications of interphase FISH on nasophayngeal carcinoma cell lineand paraffin-embeddedsections

XIE Lu，ZHOU Wen，XU liang-guo,et al.

　　【Abstract】Objective：To build up interphase FISH technique, to detect chromosome 9 and chromosome 3 copy numbers in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell lines and paraffin-embedded sections.Methods：Preparation of slide spreads of metaphase chrosomes and interphase cell lines, interphase and paraffin section fluorescence in situ hybridization (FISH).Result：Chromosome9 showed hectasomy in NPC cell lines, showed multisomy change too in paraffin-embedded NPC tissue. Chromosome 3 showed trisomy in NPC cell lines, but copy munber is normal in NPC tissue.Conclusion： Interphase fISH is a technique of wonderful application perspective, may be used in archival paraffin-embedded tissues to detect chromosome copy changes and/or specific gene amplification or deletion, may be helpful in tumor diagnostics, and is worth of wide use.

　　Key words：Interphases; Fluorescence in situ hybridization; Nasopharyngeal carcinoma; Paraffin-embedded sections

　　传统的细胞遗传学信息通常是从中期染色体中得来。对实体瘤来说需作组织培养，提取细胞制备分裂相再作核型分析。步骤繁琐，成功率极低。其它细胞遗传学手段，如流式细胞分析(FCM)仅能定量肿瘤细胞群体的总DNA含量作出非整倍性估价，无法了解单个的染色体畸变。1986年，Cremer首次提出间期细胞遗传学的概念，即以标记的核酸探针用原位杂交的方法在完整细胞核中观察染色体的畸变^[1]。1991～1992年，荧光原位杂交(简称FISH)开始成为间期细胞遗传学的基础，应用于恶性肿瘤间期核检测染色体数目畸变。FISH具有探针稳定、操作安全、可快速多色显示多个不同探针杂交信号等优点，以日新月异的速度进展，几乎成为间期细胞遗传学的代用语。鼻咽癌为中国南方特色癌肿，对其分子机理已有许多研究。曾报道鼻咽癌中有9号和3号染色体区域性缺失，但未曾作过9号和3号染色体数目畸变的考察，FISH这一技术也还从未在鼻咽癌中运用过。因此我们采用9号和3号着丝料探针，在鼻咽癌及其它细胞系中考察9号和3号染色体拷贝数的变化，并进一步在福尔马林固定、石腊包埋的鼻咽癌组织切片中考察9号和3号染色体数量变化。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　HeLa(宫颈癌)、A59(肺癌)、HEPG2(肝癌)、HNE1及HNE2(鼻咽癌)细胞系由本所细胞培养中心提供。FISH所用探针：地高辛(Dig)标记之9号α卫星DNA探针和生物素(Biotin)标记之3号α卫星DNA探针均来自Boehrringer manheim公司。采用试剂盒有：杂交试剂盒，地高辛－罗丹明(Rhodamine)检测试剂盒，生物素－异硫氰酸荧光素(FITC)检测试剂盒，均来自Oncor公司。

　　1.2　主要仪器

　　日本Nikon OPTIPHOT荧光显微镜，照像系统为AFX-IIA。滤光片组合为B-2A，UV，G2。

　　1.3　方法

　　1.3.1　中期染色体片制备：取肝素抗凝外周静脉血180 μl加入5 ml含20％胎牛血清的1640培养液中，加植物血凝素(PHA)2 mg，37 ℃培养68小时(h)。加入秋水仙素，终浓度为0.04μg/ml,继续培养2.5 h。收集细胞于离心管，1000 rpm，10分钟(min)，去血浆。用0.075M kCL 10ml低渗处理，37℃，30 min。加固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1 ml预固定，2000 rpm,离心10 min,去上清。用固定液重复固定2次。用适量固定液重悬细胞，滴片。细胞系间期细胞滴片制备：取已培养好的癌细胞，镜下观察已贴壁融合。0.125％胰酶处理消化细胞，1000 rpm，10 min，去上清。用10 ml 0.075 MKCL低渗处理细胞，37 ℃，30 min。预固定1 min，固定1次，滴片。

　　1.3.2　染色体片及细胞滴片FISH：①玻片准备：玻片用RNase酶100μg/ml，37 ℃消化1 h。ddH₂O漂洗，入酒精系列脱水。用变性液(70％甲酰胺·2XSSC)变性：72℃，4min，迅速置-20℃预冷酒精系列脱水。②探针准备：取1μ1(20ng)探针，溶于10 μl VI号杂交液中。探针变性为78 ℃，5 min，置冰上5 min。③杂交：杂交液覆于玻片细胞区后覆以腊膜、封胶带，置湿盒，37℃杂交过夜。④洗脱：1XSSC，72 ℃，5m in，入1XPBD2 min。⑤检测：对Dig-chromosome9 centromere探针采用罗丹明检测系统，分别加羊Rhodamine/Anti-Dig抗体(Ab)，兔抗羊Ab，Rhodamine/Anti-兔Ab,37℃，各15 min，中间间以1XPBD洗涤，3×2 min。最后用10 μ1 DAPI染色封片，置荧光显微镜下观察、拍照、计数并记录结果。对Biotin-chromosome3 centromere采用FITC检测系统，分别加FITC/Avidin, anti-avidinAb, FITC/Avidin。最后用PI衬染封片^[2]。

　　1.3.3　石腊切片FISH：福尔马林固定，石腊包埋鼻咽癌组织块切成4μm厚，贴于Apes胶处理过之洁净玻片，晾干，65 ℃干烤过夜。切片脱腊：二甲苯5 min×3次，过100％乙醇，2次；预处理：30％亚硫酸氢钠，43 ℃，15～30 min。0.25 mg/ml蛋白酶K消化，此为石腊切片FISH操作之关键步骤，37℃，40～60 min，应视不同组织块切片进行调整。组织片变性78℃，8 min。杂交后洗脱条件为：50％甲酰胺·2×SSC，43 ℃，15 min；2×SSC，37 ℃，10 min，2次。其余步骤同上^[3]。

　　2　结果

　　2.1　探针质量检测

　　将Dig标记9号着丝粒探针杂交于正常人外周血染色体制片，计数20个分裂相和100个间期核，发现各分裂相9号染色体中心粒均有红色杂交信号，间期核100％杂交率，见2个杂交信号点。将Bio标记3号着丝粒探针杂交于正常外周血中期片，所得结果同上，信号为黄绿色。说明探针质量可靠。见图1。

图1.9号中心粒探针(a)和3号中心粒探针(b)在中期片上示正常染色体表现，100X.

　　2.2　鼻咽癌及其他肿瘤细胞系染色体数目检测情况

　　在荧光显微镜油镜下，以合适滤光片观察，计数200个核，分别计算杂交信号为0、1、2、3、4、5、6、及以上细胞百分数，结果总结如表1。

表1　五株肿瘤细胞系间期核用FISH检测9号染色体和3号染色体数目情况

　　从表中可见探针杂交率高，因信号为0和1的细胞百分数很低。虽然FISH可检测出一种细胞系中存在单条染色体改变的异质性，但仍然可依据最主要的异常改变(即异常细胞数超过60％)来基本定型，如对9号染色体而言，宫颈癌细胞系为三倍体，肺癌为三倍体，鼻咽癌为六倍体，仅肝癌细胞系为正常二倍体。在细胞系中9号染色体的数目畸变都表现为多倍体，这也证实了多倍性是细胞恶性程度高的特征之一。对3号染色体而言，宫颈癌为正常二倍体，肺癌为二倍体，肝癌为二倍体，鼻咽癌细胞系一株为二倍体和三倍体的嵌合体，一株为三倍体。说明在不同癌中不同的染色体呈现非整倍性改变。鼻咽癌细胞系FISH见图2。

图2.9号染色体(a)在鼻咽癌细胞系HE2中示六位体，3号染色体(b)在HNE2中示三倍体，400X.

　　2.3　FISH在鼻咽癌石腊切片中的应用

　　将上述探针应用于常规石腊切片，在优化消化及变性条件等关键步骤后也得到了良好结果，见图。在五例鼻咽癌组织中发现9号染色体在癌巢中也呈多倍体表现，但在周围小而圆的侵润淋巴细胞核中则仍为正常二倍体表现，说明9号染色的多倍性可能是细胞恶性变的指征之一，有一定的诊断意义。在五例鼻咽癌组织中3号染色体呈正常二倍体表现，见图3。

图3.9号染色在鼻咽癌石腊切片中的多倍体表现和淋巴细胞中的正常二倍体(a)，3号染色在鼻咽癌石腊切片中为正常二倍体(a).100X.

　　3　讨论

　　曾在膀胱移行细胞癌、结肠癌、黑色素瘤中用FISH检测到9号染色体数目异常，其中尤以9号染色体丢失为膀胱癌最频发的早期基因畸变事件^[4～5]。3号染色体在非小细胞肺癌中存在3P杂合性缺失(LOH)和3号拷贝数增多并存的情况。说明LOH可在染色体复制情形下发生^[6]。3号染色体数目异常还在肾细胞癌中、黑色素瘤中用FISH检测到^[7～8]。在眼色素层黑素瘤中，3号染色体单倍性是预后不好的指征，而在结合膜黑素瘤中3号染色体的增多可能只是一种非特异的畸变，只是肿瘤进展期的特征性改变——多倍性的指征之一。

　　9号染色体畸变与鼻咽癌的关系目前最有证据的是9p21-22区域缺失，主要涉及潜在抑瘤基因p16/MTS1的失活，认为主要是通过纯合性或半合性缺失导致的下调机制作用，而非点突变引起^[9～10]。我们在鼻咽癌细胞系及鼻咽癌石腊切片中观察到9号染色体呈多拷贝数改变，有两种理解，其一即9P21-22的LOH发生于9号染色体复制之前，而复制的9号染色体均为此LOH的纯合子。其二即9号染色体的多倍性为肿瘤进展期染色体多拷贝数变化之一，代表了细胞的恶性特质和程度。总之，9号染色体数目改变与鼻咽癌的关系尚未见报道。

　　3号染色体与鼻咽癌的关系表现在3p的区域性缺失(3p25.3～26．3）^[11]及3q的重排^[12]。其中3p的缺失在鼻咽癌的多步发生学中可能是较关键的事件之一。我们在鼻咽癌细胞系中检测到3号染色体有三倍体表现，但在石腊切片中3号染色体数目呈正常二倍体表现，可能在癌细胞建株和传代过程中发生了3号染色体数目畸变，在原发鼻咽癌中并不存在。

　　早期FISH主要用于基因组物理图谱的绘制，随着物理制图的日趋完善及其它相关领域的发展，FISH的应用将日益转到肿瘤及其它遗传相关疾病的诊断和预后上来。CGH(比较基因组杂交)的主要进展之一就是将其应用于存档肿瘤标本的回顾性研究，尤其是当CGH用经过组织学定性，然后显微切割的肿瘤物质DNA来操作时，CGH可建立肿瘤表型与染色体改变的相关性及绘出实体瘤进展中染色体改变的序列性^[13]。HGP(人类基因组)计划预计将在2005年前完成人类近10万个基因的定位和分离。高分辨的基因表达谱技术正飞速发展^[14]。所有这些将使有关肿瘤特异遗传改变的知识扩展，特异瘤基因和肿瘤抑制基因的知识不断丰富，可用于肿瘤诊断和预后的基因探针将会越来越多，间期细胞遗传学也将成为把细胞形态学和遗传学进行整合的最为有力的桥梁技术^[15]。建立间期FISH的方法并最终将之用到临床存档的鼻咽癌石腊标本，正是我们基于上述认知而对鼻咽癌的基础研究尤其是促进基础研究到临床研究之转化的添砖加瓦。还有大量的应用领域等待着我们去开发。

　　基金项目：本课题受国家自然科学基金重点项目(39730200)资助

　　参考文献

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收稿日期：1999－03－02