肺癌患者基质分解素-1基因表达的研究

肿瘤 2000年第6期第20卷 基础研究

作者：王爱民　李伟中　郭春江　李卫杰

单位：王爱民　李伟中　郭春江　李卫杰（解放军二五二医院实验中心　保定 071000）

关键词：肺肿瘤；基因，基质分解素-1；PCR

　　摘要：目的　了解基质分解素-1基因在肺癌中的表达水平。方法　19例肺癌患者术中取癌组织及癌旁肺组织；提取组织总RNA；用逆转录共扩增定量PCR方法测定基质分解素-1(MMP₃)基因表达水平。结果　肺癌组织基质分解素-1基因表达水平明显高于癌旁肺组织。肺癌患者MMP₃基因表达水平与肿瘤大小、肿瘤组织学类型无关。结论　基质分解素-1在肺癌的进展中可能起重要作用。

　　中图分类号：R734.2　　文献标识码：A　　文章编号：1000-7431(2000)06-0404-02

STROMELYSIN-1 GENE EXPRESSION IN PATIENT WITH PULMONARY CARCINOMA

WANG Ai-min　LI Wei-zhong　GUO Chun-jiang

　　Central Laboratory of 252 Hospital,PLA, Baoding,071000

　　Abstract：Objective　To investigate stromelysin-1(MMP₃) gene expression in patients with pulmonary carcinoma.Methods　Cancerous tissue and surrounding noncancerous lung tissue were obtained from 19 patients with lung cancer and total RNA was isolated from tissues. Stromelysin-1 gene expression level was measured by quantitative analysis of reverse transcription polymerase chain reaction.Results　Stromelysin-1 gene expression level in cancerous tissue was much higher than that of surrounding noncancerous lung tissue. MMP3 gene expression level showed no correlation with tumor size and histological type of lung cancer.Conclusion　Stromelysin-1 may play an important role in invasion of pulmonary carcinoma

　　Key words：　Lung neoplasms;　Gene,Stromelysin-1；　PCR

　　肿瘤细胞对其周围组织的溶解、破坏是肿瘤浸润、转移的基础，其中基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)发挥了重要作用。基质分解素-1(Stromelysin-1,MMP₃)是基质金属蛋白酶的一种，它在肺癌中的作用尚少报道。我们采用逆转录共扩增定量PCR方法研究了肺癌患者MMP₃基因表达水平的变化，现报道如下：

　　材料与方法

　　一、对象　肺癌患者19例，其中男12例，女7例，平均年龄63±11岁。对所有患者均于术中取癌组织及癌旁组织各1块，迅速投入液氮，在标本留取1周内行RNA提取。癌组织经病理检查确诊。

　　二、试剂　总RNA提取试剂盒(Total RNA Isolation System)、AMV逆转录酶RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 Primers、Taq酶、PCR Markers、琼脂糖均为Promega公司产品。

　　三、仪器　毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品；凝胶成像系统：Kodak digital science system DC-40。

　　四、RNA提取　用Promega公司生产Total RNA Isolation System提取组织总RNA。采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀需在1.8～2.0间。

　　五　cDNA合成　采用10 μl逆转录反应体系；含待测RNA 1 μg，AMV 15单位，RNA酶抑制剂20单位，Olidgt(15 Primer)50 μg/ml及1 μl dNTP(10 mmol/L)、2 μl 5×RT buffer，42 ℃反应1 h；95 ℃ 5 min灭活AMV。

表1　MMP₃及β-actin PCR引物的序列

　　六　共扩增-PCR　参照Noonan^［1］等的方法进行。基质分解素-1(MMP₃)引物的设计参照Genebank资料及Lichtinghagen^［2］等的设计；内参对照β-actin的引物设计参照Genebank资料。

　　PCR反应体系为20 μl，内含cDNA 2 μl，10 × buffer 2 μl，4×dNTP(2 mmol/L) 2 μl，MMP₃、β-actin引物(10 μmol/L)各2 μl，Taq酶1U，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94 ℃预变性2 min。94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃后延伸7 min。

　　七、扩增产物定量分析　扩增产物在2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，MMP₃和β-actin的扩增产物分别为194 bp和234 bp。对扩增产物用凝胶成像系统进行定量分析，用MMP₃/β-actin的比值表示MMP₃相对表达水平。

　　八、统计处理　结果以±s表示，用单因素方差分析进行处理。

　　结　　果

　　癌旁肺组织可见基质分解素-1基因的表达；肺癌组织基质分解素-1基因的表达水平明显高于癌旁肺组织(P＜0.001)(见表2，图1)。

表2　肺癌患者基质分解素-1(MMP₃)基因的表达

　　^***P＜0.001　　将肺癌组织MMP₃基因表达水平与肿瘤大小行相关分析表明两者无相关性(r=0.180,n=19 P＞0.05)。

　　鳞癌(1.20±0.46 n=11)与腺癌(1.27±0.39 n=8)两种组织类型不同的肺癌间MMP₃基因表达无显著差异(P＞0.05)。

图1　肺癌患者MMP₃的基因表达。第1道为癌旁肺组织；第2、3道为肺癌组织；第4道为PCR分子量标准，从大到小为1000 bp、750 bp、500 bp、300 bp、150 bp。

　　讨　　论

　　基质金属蛋白酶主要包括三大类：间质胶原酶类，Ⅳ型胶原酶/明胶酶类和基质分解素类^［3］。基质分解素-1是基质分解素的一种，可降解蛋白多糖，层连蛋白，纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原，由此可见它对细胞外基质成份有广泛的溶解作用。有关基质分解素-1与肿瘤关系的研究目前报道尚少。我们采有逆转录共扩增定量PCR方法研究了肺癌患者MMP₃基因的表达，结果表明：肺癌组织MMP₃基因表达水平明显高于癌旁组织；且与肿瘤大小、肿瘤组织学类型无关。此结果虽不能说明MMP₃基因表达增强是肺癌浸润、转移的原因，但它提示肺癌组织较癌旁组织溶解周围组织的能力明显增强。关于肿瘤组织中MMP₃的细胞来源目前尚不甚清楚，多认为是肿瘤周围的基质成纤维细胞产生^［4］，肺癌组织中MMP₃的细胞来源，作者正在研究之中。影响基质分解素-1基因表达的因素很多，如TGFβ、TNFα、PDGF、EGF、bFGF、C-Fos、C-Jun等^［5，6］，对肺癌患者MMP₃基因表达增强的调控机理尚需进一步研究。

　　王爱民，男，医学博士，副主任医师。

　　参考文献

　　［1］Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR₁(multidurg resistane) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:7160

　　［2］Lichtinghaen R, Helmbrecht T, Arndt B, et al. Expression pattern of matrix metalloproteinases in human liver〔J〕. Eur J Clin Chem Biochem,1995,33:65-71

　　［3］王爱民，王宝恩.基质金属蛋白酶〔C〕.国外医学临床生物化学与检测学分册，1995，16：245

　　［4］Polette M, Clavel C, Muller D, et al. Detection of mRNAs encoding collagenase-Ⅰ and stromelysin-2 in carcinomas of the head and neck by in situ hybridization〔J〕. Invasion Metastasis,1991,11:76

　　［5］Quinones S, Saus J, Otani Y, et al. Transcriptional regulation of human stromelysin〔J〕. J Biol Chem,1989,264:6339

　　［6］Kerr LD, Holt JT, Matrision LM, et al. Groupth factors regulate transin gene expression by C-Fos-dependent and C-Fos-independent pathway〔J〕. Science,1988,242:1424

(收稿日期：1999-07-29；修回日期：1999-11-24)