原发性非小细胞肺癌(NSCLC)中MTS2/p15基因丢失的研究

肿瘤 1999年第1期第19卷 论著

作者：许凯黎　廖美琳　丁嘉安　周　瑾　钟晓松　陆明华

单位：许凯黎　周　瑾　钟晓松　陆明华(上海市肿瘤研究所(上海200032)；廖美琳（上海市胸科医院）；丁嘉安（上海市第一肺科医院）

关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；PCR；基因，p15；染色体缺失

　　目的　探讨MTS₂/p15基因缺失与人体非小细胞肺癌(NSCLC)的发生及发展的相关性。方法　采用聚合酶链式反应(PCR)技术，分别检测160例不同病理类型及分期的肿瘤组织，10例非癌性肺组织及2例胎肺组织中p15基因的纯合性丢失。　结果　160例NSCLC组织中p15基因的丢失率以腺癌为最高64.7%，鳞癌其次43.9%，混合型鳞腺癌为最低37.0%，10例非癌性肺组织及2例胎肺组织均未见有p15基因的丢失。经TNM分期分析表明，Ⅰ期p15基因丢失率为34.6%，Ⅱ期为47.4%，Ⅲ期为61.4%，Ⅲ期的p15丢失率明显高于Ⅰ期(P＜0.005)。　结论　MTS2/p15基因缺失除与NSCLC的发生相关外，还可能涉及到患者病程的进展。

HOMOZYGOUS DELETION OF MTS2/p15 GENE IN

　　PRIMARY NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA

Xu Kaili,Liao Meilin,Ding Jiaan,et al.Shanghai Cancer Institute,Shanghai,200032

　　Objective：To investigate the relationship between clinicopathologic feature and homozygous deletion of p15 gene in non-small cell lung cancer.Methods：160 cases with non-small cell lung cancer,10 cases with benign lung diseases and 2 cases with fetal lung tissues were examined by polymerase chain reaction-based analysis for homozygous deletion of MTS2/p15 gene.Results：The rate of p15 gene deletion was 49.3% in non-small cell lung cancer,including 64.7% in adenocarcinoma,43.9% in squamous carcinoma and 37.0% in mixed adeno-squamous carcinoma,but none of p15 gene deletion occured in benign lung diseases and fetal lung.Interestingly,there was a relationship between the stage of clinical pathology and the rate of p15 gene deletion.Among them,the rate of p15 gene deletion in NSCLC was 34.6% in stage Ⅰ,47.4% in stage Ⅱ and 61.4% in stage Ⅲ (P＜0.05).Conclusion：A lack of p15 gene was observed frequently in adenocarcinoma than in squamous cell carcinoma and was found to be closely related to clinical stages of NSCLC.

　　Key words　Lung neoplasms　Carcinoma,non-small cell lung　PCR　Genes MTS2/p15　Chromosome deletion

　　癌基因的激活和抑癌基因的失活与恶性肿瘤的发生之间的相关性，现已成为肿瘤分子生物学研究的热点。通过人体肺癌的发生及发展的细胞遗传学并结合分子生物学研究，已充分揭示肿瘤细胞中多对染色体上频繁发生丢失，如3p，4p,5p,9p,11p,13p和17p,其中以3p，9p和17p尤为突出。最近，人们从染色体9p21区域处分离出两个细胞周期素依赖性激酶抑制因子的新成员，p16(MTS1)和p15(MTS2)基因，并发现p16基因丢失可能与家族性人体黑素瘤演变相关^［1，2］。继后，在多种肿瘤细胞株和原发性肿瘤中相继观察到p15、p16基因发生纯合性丢失，从而提示p15、p16基因可能为人体多种肿瘤发生相关的抑癌基因。近年文献报道人体肺癌细胞株及原发性非小细胞肺癌中p16基因均可发生变异，并与NSCLC患者病程进展相关^［3～8］。然而，对于人体原发性NSCLC手术标本中p15基因的丢失仍少见报道。为此，本文采用PCR法，检测及分析上海地区经病理证实的160例NSCLC组织中p15纯合性丢失，以期比较研究NSCLC病理分型及临床分期与p15基因丢失的相关性。

　　材料与方法

　　一、组织标本来源

　　组织标本分别来自上海市胸科医院，上海市第一肺科医院，华东医院。新鲜手术切除标本在1小时内存放于液氮保存。经病理证实的160例非小细胞肺癌组织(其中包括鳞癌82例，腺癌51例及混合性鳞腺癌27例)，10例非癌肺疾患组织及2例胎肺组织，在作DNA大分子纯化前均放于液氮条件下冻存。

　　二、主要试剂

　　琼脂糖(Promega公司)，dNTP，Taq酶及DNA标准分子量Marker(华美公司)。p15 Exon 2及β-actin引物均由中科院细胞生物学研究所合成。

　　三、DNA纯化及PCR扩增

　　(一)DNA纯化　参照Maniatis法分别纯化各种组织DNA大分子，经紫外分光光度计作DNA定量检测。

　　(二)PCR扩增及p15基因外显子(Exon 2)丢失检测

　　1.PCR反应总体积为50 μl，样本DNA量为4 μl，94℃变性5 min后，进行35个循环，条件为94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s，扩增p15基因的外显子(Exon 2)。p15基因Exon 2引物序列如下：

　　sense 5′-TGGCTCTGACCACTCTGC

　　antisense 5′-AGCGAATTCGGGTGGGAAATTGGGGTAAGAA

　　同时用β-actin基因作为内对照，扩增条件：94℃变性5 min后，进行35个循环，条件为：94℃，30 s；55 ℃，2 min，72℃，3 min。

　　β-actin引物序列为：

　　sense 5′-GAAACTACCTTCAACTCCATC

　　antisense 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC

　　2.PCR扩增产物电泳检测：

　　p15基因外显子2及β-actin经PCR扩增后，产物在1.5%琼脂糖凝胶条件下进行电泳，凡检测标本中出现β-actin基因条带而p15基因条带消失者为纯合性丢失，两者均呈现条带为无丢失。

　　四、统计学分析：组间均值比较用t检验。

　　结　　果

　　一、NSCLC组织病理分型及TNM分期：

　　本文收集原发性非小细胞肺癌组织总共为160例，其组织学分类及TNM临床分期(见表1)。

表1　原发性NSCLC组织的病理分型及临床分期

　　二、不同组织病理类型中p15基因纯合性丢失

　　采用PCR法分别对160例原发性NSCLC，10例非癌性肺疾患以及2例胎肺组织纯化其大分子DNA，作p15基因(外显子2)及内对照β-actin的基因扩增检测。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，可观察到p15基因产物分子量为291 bp以及β-actin基因分子量为285 bp(见附图)。经上述标本检测结果提示160例NSCLC中79例出现p15基因纯合性丢失，总丢失率为49.3%，其中以腺癌为最高，丢失率达64.7%(33/51)，鳞癌为43.9%(36/82)，而混合型鳞腺癌为37.0%(10/27)，10例非癌性肺癌疾患及2例胎肺均未见有丢失(见表2)。

表2　不同病理分型的NSCLC及非癌肺组织中p15基因纯合性丢失

附图　PCR法检测非小细胞肺癌组织中p15基因丢失

　　M 分子量，1正常肺组织，2～7号均为NSCLC，其中2，5，7号标本出现p15基因丢失

　　三、NSCLC的TNM分期与p15基因纯合性丢失的相关性研究

　　根据WHO标定之NSCLC中TNM分期，本文中160例NSCLC中Ⅰ期为52例，Ⅱ期为38例及Ⅲ期为70例，经PCR扩增检测NSCLC各TNM分期中p15基因丢失率，结果表明Ⅰ期丢失率为34.6%(18/52)，Ⅱ期为47.3%(18/38)，而Ⅲ期为61.4%(43/70)，从而证实NSCLC患者TNM分期与p15基因纯合性丢失呈正相关。晚期患者(Ⅲ期)中p15基因丢失率明显高于早期患者(Ⅰ期)，经统计学处理两者有显著性差异(P＜0.005)(见表3)。

表3　p15基因在160例不同临床分期的NSCLC中纯合性丢失

　　*P＜0.005讨　　论

　　近20年来，随着肿瘤分子生物学的深入研究，使人们充分地认识到正常细胞向肿瘤细胞演变的基础，在于细胞内某些癌基因的激活及抑癌基因的失活。因此，当前人们不但要进一步寻找某些与肿瘤相关的新的基因，同时还需深入探讨某些已知基因在各种肿瘤发生及发展中的作用。 1994年以来，p16，p15基因分别从人体染色体9p21-22区处分离及纯化，并发现该基因属CDK4和CDK6(cyclin-dependent kinase)的抑制因子，称为MTS1及MTS2。基因表达产物可与CDK4-cycline D复合物结合，使CDK4激活功能丧失，阻滞细胞进入G1/S期，抑制细胞生长。经采用PCR及Southern印迹法分析已充分证实p16基因在黑素瘤、神经胶质瘤、肺癌、食管癌、白血病和卵巢癌中存在缺失。显然缺失p16，p15基因均可促使细胞无限制地进入G1/S期并加快细胞分裂，最终导致细胞永生化而形成肿瘤细胞。

　　1995年，Washimi等人^［3］采用PCR及PCR-SSCP法，首次证实非小细胞肺癌细胞株及原发性非小细胞肺癌组织均可出现p16、p15基因的纯合性丢失，但在小细胞肺癌细胞株中却未见丢失。鉴于该两基因影响细胞分裂的功能主要是通过Rb基因，而小细胞肺癌中Rb基因均出现突变型，因而小细胞肺癌的演变有可能与p16，p15基因的缺失无关。本文拟通过PCR法检测上海地区不同病理分型及分期的160例非小细胞肺癌组织中p15基因的纯合性丢失，以期阐明中国人肺癌发生及发展与p15基因变异之间的相关性，实验研究结果提示160例NSCLC中出现p15基因总纯合性丢失率可达49.3%，而10例非癌性肺疾患及2例胎肺组织中均未见有丢失，从而证实NSCLC演变与p15基因的丢失密切相关。经病理组织类型分析表明腺癌中p15基因丢失率为最高，达64.7%，其次为鳞癌，43.9%，而混合型鳞腺癌为最低，37.0%。肿瘤病因学资料提示肺鳞癌的发生与吸烟相关，而腺癌与吸烟关系不大，因而p15基因的缺失与吸烟及其它因素之间的相关性研究，尚须今后深入探讨。

　　据文献探讨p15、p16基因产物可起到比p53基因更为有效的一种控制癌细胞分裂的“闸”的作用，因而在癌细胞中出现p15、p16基因的丢失，必然可导致细胞分裂速率增加及促进癌细胞的转移。Kratzke等人^［4］曾观察到NSCLC手术标本中出现p16基因的纯合性丢失均与患者预后差密切相关。Kelly^［6］等更进一步发现来自于Ⅲ及Ⅳ期之NSCLC细胞株中明显出现p16基因的纯合性丢失，而Ⅰ，Ⅱ期却少见p16基因丢失。这与本文的实验结果完全相符，p15基因的纯合性丢失频率与肺癌的分期相关，其中Ⅰ期为34.6%，Ⅱ期为47.4%，而Ⅲ期可高达61.4%，Ⅲ期明显地高于Ⅰ期并具有极其显著性的差异(P＜0.005)。最近，Taga等人^［8］采用免疫组化法，检测115例NSCLC标本中p16基因产物表达的阴性率明显与预后相关(P＜0.043)，其中早、中期的患者之间差异最为明显(P＜0.039)。由此可见，通过检测原发性NSCLC组织标本中p16，p15基因的缺失在一定程度上可反映患者的病程，并有可能为今后直接应用于临床，作为一种预测NSCLC患者预后的肿瘤标志。

　　然而，尽管人们普遍认为p16基因与p15基因两者在NSCLC中可出现共同丢失的现象^［7］，但考虑到该两种基因在各种肿瘤类型中存在不同的变异^［9］，因此两者之间在NSCLC发生及发展中功能的差异还有待于深入探讨和研究。

　　上海市医学领先学科　上海市科委资助课题

　　第一作者简介　许凯黎，男，大学本科，研究员，硕士生导师。

　　参　考　文　献

　　1　Kamb A,Gruis A,Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264(15):436

　　2　Hussussian CT,Rinder LK,Daik DF, et al. Germline p16 mutations in familiar melanoma.Nature Genet,1994,8:15

　　3　Washimi O,Nagatake M, Osada H, et al. In vivo occurrence of p16(MTS1) and p15(MTS2) alterations preferentially in non-small cell lung cancers.Cancer Res,1995,55:514

　　4　Kratzke RA,Greatens TM,Rubins JB,et al. RB and p16^INK4a expression in resected non-small cell lung cancer.Cancer Res,1996,56:3415

　　5　钟晓松，许凯黎，廖美琳，等.原发性非小细胞癌p15基因的丢失研究.肿瘤.1997，17(2)：81

　　6　Kelley MJ,Nakagawa K, Steinberg SM, et al. Differential inactivation of CDK2 an RB protein in non-small cell lung cancer cell lines.J Natl Cancer Inst,1995,87(10):756

　　7　Okamotot A,Hussain SP,Hagiwara K, et al. Differential inactivation of CDK2 an RB protein in non-small cell lung cancer cell lines.J Natl Cancer Inst,1995,87(10):756

　　8　Taga S,Osaki T,Ohgami A, et al. Prognostic value of the immunohistochemical detection of p16^INK4 expression in nonsmall cell lung carcinoma.Cancer,1997,80(3):389

　　9　Herman GJ, Jen J,Merlo A,Baylin SD.Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor for p15^INK4B1.Cancer res,1996,56:722