非小细胞肺癌中抑癌基因p16/MTS1的基因突变和表达缺失

肿瘤 1999年第1期第19卷 医疗研究

作者：石永玉　魏海明　孟　红　李　焱　孙广莲　秦立增　吴惠联　郭进林

单位：山东省医学科学院基础所微生物室(济南250062)

关键词：癌，非小细胞肺；基因p16；突变

　　1994年Kamb等^［1］在人染色体9p21发现一个新的抑癌基因p16，由于该基因在多种类型肿瘤细胞株中频繁缺失，成为近年来肿瘤分子生物学的研究热点。在人原发性非小细胞肺癌中，p16基因失活被认为与肿瘤的发生密切相关^［2］。作者采用免疫组化技术和PCR-SSCP方法，分析人原发性非小细胞肺癌中p16基因突变和蛋白表达缺失情况，着重探讨p16基因失活与肺癌的分化程度及淋巴结转移的关系。

　　材料与方法

　　1.标本　1995～1997年48例非小细胞肺癌病理存档蜡块标本，由山东省医科院病理室提供，其中22例有淋巴结转移，中、高分化者30例，低分化者18例。并用3例支气管扩张症蜡块标本作良性对照。

　　2.SABC-免疫组化染色　鼠抗p16蛋白单克隆抗体为Neomarker公司产品，工作效价1：50。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。常规石蜡切片梯度酒精脱蜡至水，然后按试剂盒说明书进行操作，最后苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。同时用支气管扩张症手术标本作正常对照，分别以PBS、正常鼠血清代替一抗作为空白对照和替代对照，以细胞核或细胞浆染成棕黄色作为阳性判定标准。

　　3.DNA提取及PCR扩增，取石蜡切片3～5片置于二甲苯中脱蜡24 h，其间不时摇动并换液3次。然后按照宝灵曼公司提供的DNA提取试剂盒的说明书操作。因p16基因约90%的突变见于Exon2，故本实验选用扩增p16基因第二外显子的上游区和下游区2对引物，由华美公司合成(见图1、表1)。PCR扩增程序：50 μl反应体系，引物200 pmol，dNTP 10 nmol，1%二甲亚砜，样品0.2 μg。95℃预变性5分钟，然后加入taq酶2 U，接着94℃ 50秒，56℃或58℃(表1)40秒，72℃ 50秒，循环30次，最后72℃保温7分钟。

表1　p16基因Exon 2引物序列

　　4.SSCP银染分析：取10 μl PCR扩增产物，加入10 μl甲酰胺变性液，混匀，95℃变性5分钟，冰上骤冷5分钟，上样8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49：1)，1×TBE为电泳缓冲液，5 mA恒电流4℃电泳12～16小时。取下凝胶，于10%乙醇中固定5分钟，然后1%硝酸溶液中脱色3分钟，蒸馏漂洗3×2分钟，置于1%硝酸银染液中摇动染色20分钟，蒸馏水漂洗30秒，30%碳酸钠-0.01%福尔马林显影液显影，最后用10%乙酸溶液适时中止反应。置凝胶于白色背影下拍照。与正常对照相比，有异常泳动条带者判断为基因突变。

1　扩增p16基因Exon2片段大小及相应部位示意图

　　结　　果

　　1　p16蛋白表达情况　阳性表达的肺癌细胞，其棕色颗粒主要分布在核内，亦见部分胞质被染成棕色。支气管扩张症正常肺组织胞质被染成浅黄色，其中尘细胞着色重。(见插页第1页图5)

　　图5　p16蛋白在NSCLC中免疫组化结果

　　A：肺鳞癌细胞核阳性着色　B.肺鳞癌中p16蛋白表达缺失

6　p16基因Exon 2 PCR产物SSCP分析图谱

　　1～2：支气管扩张症，肺组织标本，SSCP阴性，3～4，6～10：肺癌标本，SSCP阴性

　　5：肺癌标本，SSCP阳性　SS：DNA变性单链　ds:DNA变性残留双链

　　2　p16蛋白表达缺失率与癌细胞分化程度及淋巴结转移的关系。有淋巴结转移的非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者；低分化肺癌p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。腺癌与鳞癌p16蛋白缺失率无显著差异(见表2)。

表2　48例非小细胞肺癌中p16基因失活情况

　　^*与相应组别比较P＜0.05　　3． p16基因突变情况　第二外显子上游区扩增产物有1例显示异常泳动条带，下游区有1例异常(见插见第1页图6)。2例标本均为有淋巴结转移的肺癌。p16基因第二外显子突变与肺癌的分化程度及淋巴转移未见显著相关性。

　　讨　　论

　　抑癌基因p16编码的p16蛋白又称INK₄，它与cyclin D竞争结合CDK或CDK₆，从而抑制cyclin D-CDK₄或cyclin D-CDK₆复合物形成，阻碍细胞从G₁期到S期的转渡，对细胞周期的运转进行负调控^［3］。p16基因失活可导致肿瘤的形成。p16基因失活机制有多种：纯合性缺失、基因突变、5’CpG岛异常甲基化等^［4］。本文资料显示，25例非小细胞肺癌p16蛋白表达缺失(25/48)，其中2例发生基因突变，为表达缺失者的8%(2/25)，由此可见，在非小细胞肺癌中，基因突变不是p16表达失活的主要机制。针对p16基因失活的多种方式，相应的分析技术有：Southern blotting，PCR-SSCP，DNA测序以及甲基化-PCR^［5］等。这些分子生物学手段多样而繁琐，但仍难以真正判断p16基因的状态和功能。免疫组化方法相对集特异性和敏感性为一体，更全面地、最终地反映p16基因在肿瘤组织中改变的性质。本研究用免疫组化方法可以区分肿瘤细胞和正常细胞p16蛋白的表达，并发现非小细胞肺癌中p16蛋白的表达缺失率基本上与荧光原位杂交结果相吻合^［6］。

　　本资料显示p16蛋白主要位于细胞核，但也有少部分细胞质着色而胞核不着色，说明胞质也可能存在p16蛋白。以支气管扩张症肺组织作正常对照，染色结果表明正常肺组织p16蛋白表达水平较低，而在某些染色阳性的肺癌组织中则观察到胞核深染，Shapiro认为这是正常组织野生型Rb基因抑制了p16基因的表达^［7］。结合目前对p16基因的研究，可解释如下：p16蛋白的表达与细胞周期密切相关。p16基因有三个外显子E₁、E₂、E₃。其中E₁又分为E₁α和E₁β，可分别与E₂、E₃组成不同的阅读框架，即p16有两种RNA：α-mRNA和β-mRNA。这两种转录子在细胞周期不同时相中比率不同，在G₀期β构成低，进入S期β：α上升，p16基因表达水平达到高峰，可高至原来的10倍^［8］。β-mRNA在体内可能不翻译，但参与p16蛋白翻译调控。所以，在终末分化的正常肺组织中，p16表达量很低，而在增殖旺盛的癌组织中，野生型p16基因反而可以高度表达。

　　本实验结果发现，p16蛋白表达缺失率与非小细胞肺癌的组织学分型无关，与患者的年龄、性别无关，但是低分化非小细胞肺癌的p16蛋白表达缺失率显著高于中、高分化者。提示p16蛋白表达缺失与癌细胞分化程度相关。有文献报道神经胶质瘤的分化程度与p16基因表达缺失相关^［9］，甲状腺癌的恶性程度也与p16基因缺失有一定的联系^［9］。这可理解为：p16基因失活导致细胞增殖失控，失去正常分化能力。因此，p16基因失活有可能作为判断肿瘤细胞恶性程度的标志。

　　在所检测的非小细胞肺癌中，伴有淋巴结转移者的p16蛋白表达缺失率显著高于无淋巴结转移者，并且2例有基因突变的非小细胞肺癌皆有淋巴结转移。提示p16基因改变与肺癌淋巴结转移有关。Maesawa等^［10］发现食管癌中p16基因缺失和甲基化与癌细胞的淋巴结转移和肌层浸润密切相关。Hsu等^［11］认为p16基因和nm₂₃基因与肿瘤转移有关。他发现肺癌CH₂₇细胞中p16蛋白表达水平随该细胞转移活性的降低而下调。p16是否是一种肿瘤转移抑制基因?这尚需进一步研究。但有一点勿庸置疑，由于p16基因失活与非小细胞肺癌淋巴结转移密切相关，p16基因状态检测可用来评估肺癌病人的预后。

　　第一作者简介　石永玉，男，硕士，助教。

　　参　考　文　献

　　1　Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264:436

　　2　Hayashi N, Sugimoto Y, Tsuchiya E, et al. Somatic mutations of the MTS (multiple tumor suppressor)₁/CDK₄I(cyclin-dependent kinase-4 inhibitor) gene in human primary non-small cell lung carcinomas. Biochem Biophys Res Commun, 1994, 202:1426

　　3　Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory modify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK. Nature, 1993, 336:704

　　4　Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN₂/MTS-1/INK_4A)inactivation in head and neck squamons cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3630

　　5　Herman JG, Craff JR, S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:9821

　　6　Xiao S, Li D, Corson JM, et al. Codeletion of P¹⁵ and p16 genes in primary non-small cell lung carcinoma. Cancer Res, 1995, 55:2968

　　7　Shapiro GI, Edwards CD, Kobzik L, et al. Reciprocal Rb inactivation and p16 INK₄ expression in primary lung cancers and cell lines. Cancer Res, 1995, 55:505

　　8　Stone S, Jiang P, Dayananth P, et al. Complex structure and regulation of the p16(MTS₁)locus. Cancer Res, 1995, 55:2988

　　9　Tung WS, Shevlin DW, Bartsch D, et al. Infrequent CDKN₂ mutation human differentiated thyroid cancer. Mol Carcinog, 1996,15:5

　　10　Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN₂ gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996, 56:3875

　　11　Hsu JW, Hsu SL, Chu JJ, et al. Increased NM₂₃：MTS₁ ratio inversely correlated with metastasis behaviour in human lung squamous cell carcinoma. Anticancer Res, 1997, 17:407

(收稿：1998-03-30　修回：1998-06-26)