非小细胞肺癌MAGE-3基因产物的表达

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：刘庆伦　张昌卿　冯凯涛

单位：刘庆伦（中山医科大学肿瘤防治中心肿瘤研究所病因室，广州，510060)；张昌卿（肿瘤医院中心实验室)；冯凯涛（肿瘤医院中心实验室)

　　关键词： 肺肿瘤；癌，非小细胞肺；MAGE-3基因产物；基因表达

　　【摘要】　目的　检测 MAGE-3基因编码的抗原在非小细胞肺癌表达的情况，探讨MAGE-3抗原的表达与患者临床表现的关系，以及利用MAGE-3 基因产物对非小细胞肺癌患者进行特异性免疫治疗的可能性。方法　用免疫组化LSAB 的方法对石蜡包埋的组织切片进行MAGE-3抗原的检测。结果　104 例非小细胞肺癌原发灶肿瘤组织切片中，MAGE-3 抗原阳性者31例，阳性率29.8%。MAGE-3 抗原阳性患者肿瘤转移率（30.0%）明显低于阴性患者的转移率 （56.1%，P＜0.05），MAGE-3 抗原阳性患者18个月的生存率（88.2%）明显高于阴性患者生存率（52.9%，P＜0.01）。结论　非小细胞肺癌有较高比例的MAGE-3 抗原表达，并与患者的预后相关。对MAGE-3 抗原阳性NSCLC患者，可以利用MAGE-3 抗原作为靶分子进行免疫治疗。

Expression of MAGE-3 gene product in non-small cell lung cancer

LIU Qinglun，ZHANG Changqing，FENG Kaitao.

　　（Cancer Institute of Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the expression of MAGE-3 antigen in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods　The expression of MAGE-3 antigen was examined in formalin fixed, paraffin embedded sections of NSCLC by LSAB immunohistochemical technique.Results　MAGE-3 antigen was detected in 31 of 104 (29.8%) patients with primary NSCLC. The frequency of MAGE-3 expression was significantly correlated to the absence of metastasis (P＜0.05) and better survival rate (P＜0.01). There was no significant relationship between MAGE-3 expression and histological type of NSCLC.Conclusion　MAGE-3 antigen expression in NSCLC correlates with better prognosis. It is a candidate molecular target for specific immunotherapy for NSCLC patients.

　　【Subject words】　Lung neoplasms;　Carcinoma,non-small cell lung;　MAGE-3 gene product;　Gene expression

　　人类MAGE（melanoma antigen）基因家族编码的肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen）在细胞内经加工后产生的抗原肽，可与HLA-Ⅰ类分子结合，形成抗原—HLA-Ⅰ类分子复合物，递呈至细胞表面，为自体细胞毒性T-淋巴细胞（CTL）识别^［1］，进而诱导CTL增殖，提高其杀伤对应肿瘤细胞的活性。MAGE 基因在许多肿瘤有较高的表达，但是在正常组织（除了睾丸和胎盘外）均不表达，因而是一种CTL 介导的肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。有学者认为，这是找到了肿瘤特异性免疫治疗的新途径^［2］。目前，国内尚未见到有关对MAGE-3 基因研究的报道。我们进行了MAGE-3基因产物在非小细胞肺癌（NSCLC）表达的初步研究，探讨鉴定 MAGE-3抗原阳性患者的简便可靠方法，以及利用 MAGE-3基因产物对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。

　　材料与方法

　　1.研究对象：104例NSCLC标本均取自中山医科大学附属肿瘤医院，全部经手术及病理诊断确诊。其中，肺鳞状细胞癌43例，肺腺癌 40例，肺鳞腺癌11例，肺细支气管肺泡癌7例，肺大细胞癌3例。男性82例，女性22 例。年龄31～74岁，平均52.5岁。

　　2.试剂： 抗 MAGE-3 基因编码抗原的小鼠单克隆抗体57B，系由MAGE-3 重组蛋白免疫小鼠制成^［3］，由瑞士Basel 大学Gudat 教授和Spagnoli 博士惠赠。第二代LSAB检测试剂盒等均为Dako公司产品。

　　3.方法：LSAB免疫组化法：参照Gudat等^［4］报道的方法，略加修改。即：抗原修复缓冲液用0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液，pH为6.0，微波炉以高、中、低功率档各加热5 min，保持缓冲液为沸腾状态，并改在二抗孵育标本后，加3% H₂O₂阻断内原性过氧化酶，其余基本不变。MAGE-3 基因产物定位于胞浆，在细胞内经加工后产生的抗原肽与HLA-Ⅰ类分子结合，递呈到细胞表面，阳性肿瘤细胞胞浆、胞膜被染成不同深浅的棕色。我们根据肿瘤细胞染色的程度制定如下判断标准：-：没有观察到棕色的阳性细胞；＋： 阳性细胞胞浆染成均匀浅黄色；＋＋：阳性细胞胞浆染成棕色，并含一些较细的棕色颗粒；＋＋＋：阳性细胞胞浆染成深棕色，并有较粗大的深棕色颗粒(图1～4)。

　　图1 肺鳞状细胞癌MAGE-3基因产物阳性(+++).LSAB免疫组化染色,DAB显色,苏木素复染,癌细胞染成深棕色10×10 图2 肺鳞状细胞癌MAGE-3基因产物阳性(+++).LSAB免疫组化染色,DAB显色,苏木素复染,癌细胞染成深棕色 10×40 图3 肺鳞腺癌MAGE-3基因产物阳性(+++).LSAB免疫组化染色,DAB显色,苏木素复染,癌细胞染成深棕色 10×10 图4 肺鳞状细胞癌MAGE-3基因产物阴性(-).LSAB免疫组化染色,DAB显色,苏木素复染,癌细胞与非癌细胞均示染上棕色 10×10

　　结果

　　104例NSCLC患者中，29.8%的患者肿瘤细胞表达MAGE基因编码的肿瘤排斥抗原（MAGE-3 抗原），阳性率及阳性等级与病理类型无相关性（P＞0.05，表1）。对其中86例资料齐全的 NSCLC 患者手术时确诊的肿瘤转移情况（绝大多数为淋巴结转移，个别为胸膜或肺原发灶以外的肺转移）进行分析，结果见表2。经四格表卡方检验： χ²_0.05＝3.84，在本例中，χ²＝4.17＞3.84，故P＜0.05。表明MAGE-3抗原阳性组肿瘤转移率明显低于阴性组。

　　大多数患者手术后至今观察的时间为18 个月左右，除去部分不配合或手术后不到18个月的患者外，我们对资料可靠的68例患者进行了18个月生存率分析(患者死因均为肿瘤)，结果见表3。经四格表卡方检验：χ²_0.01＝6.63，在本例中，χ²＝6.73＞6.63，故P＜0.01，表明MAGE 抗原阳性组患者的18个月生存率明显高于阴性组。5年生存率正在继续观察之中。

表1　NSCLC患者MAGE-3基因产物的表达

表2　NSCLC患者肿瘤转移率比较

表3　NSCLC患者18个月生存率比较

　　讨论

　　人类MAGE 基因家族定位于X染色体，至少由12个紧密相关的基因成员组成，这些成员的基因序列大约有64%～85% 的同源性。MAGE-3基因编码的九肽：苯丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸（FLWGPRALV），可与HLA-Ⅰ类分子形成复合物，递呈到细胞表面，成为所谓“肿瘤排斥抗原”，并为CTL识别及诱导CTL 对肿瘤细胞的特异性杀伤。因此，MAGE-3 基因在肿瘤细胞表面的表达情况是影响肿瘤免疫治疗的重要因素。目前，已经证实，插入了MAGE-1基因的雀痘病毒载体（Carnarypox virus-based vector) 转染的自体外周血单个核细胞与MAGE-1基因表达的患者TIL共育，可诱导肿瘤特异的CTL的大量增殖并提高其杀伤活性^［5］，MAGE基因编码的并由HLA-Ⅰ类分子递呈的九肽与抗原递呈细胞(APC)共孵育，然后再将其用于刺激自体T淋巴细胞，也可产生前述效果^［6］。MAGE基因表达阳性的患者体内实验表明：皮下及静脉注射MAGE 基因编码的多肽孵育过的自体APC 或灭活的自体（包括相同HLA 型的）MAGE抗原阳性的肿瘤细胞，均可诱导患者体内肿瘤特异的CTL 的增殖^［7，8］。此外，以氮杂脱氧胞苷（5-Aza-1-deoxycytidine）与肿瘤细胞共育，上调MAGE 基因产物的表达，也有利于自体CTL 对该种肿瘤细胞的识别与杀伤^［9］。目前，寻找MAGE 抗原阳性的肿瘤患者，并对这类肿瘤患者进行针对MAGE 基因产物的特异性免疫治疗，已成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一。

　　由于肿瘤细胞的异质性，同一肿瘤的细胞可表达不完全相同的抗原，这给选择免疫治疗的靶抗原带来了很大的困难。我们的研究发现，异质性对 MAGE-3 抗原的表达影响不大，我们检测的104例NSCLC中，未见同一标本中部分肿瘤细胞 MAGE-3 抗原阳性而另一部分为阴性的情况，只是见全部肿瘤细胞MAGE-3抗原阳性或阴性。这也提示，选用MAGE-3 基因产物作为靶分子对阳性患者进行免疫治疗，有可能对全部的肿瘤细胞均产生杀伤效应，因而较其它免疫疗法更特异也更简单有效。

　　本组结果显示，MAGE-3 抗原阳性组患者肿瘤转移率明显低于阴性组；手术后证明无转移的14 例中，MAGE-3抗原均为阳性，术后18个月无一例发生转移。术后证明无转移而MAGE-3抗原阴性的29例，术后18个月有5例发生转移（由于病例较少，经统计学处理未见显著性）。

　　本组观察结果表明，MAGE-3抗原阳性组患者的生存率较高，预后较好。这一结果与 Ishida等^［9］的报道相符，提示MAGE-3阳性的NSCLC患者也适于以MAGE-3 基因或其抗原肽进行特异性免疫治疗。

　　参考文献：

　　［1］　Vanden BP, Traversari C, Chomez P, et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on human melanoma. Science, 1991, 254:1643-1647.

　　［2］　Inoue H, Mori M, Li J, et al. Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes. Int J Cancer, 1995,63:523-526.

　　［3］　Schultz TE, Juretic A, Dellabona P , et al. MAGE-1 gene product is a cytoplasmic protein. Int J Cancer, 1994, 59: 435-439.

　　［4］　Gudat F, Zuber U, Durmuller ü, et al. The tumour-associated antigen MAGE-1 is detectable in formalin-fixed paraffin section of malignant melanoma. Vichows Arch, 1996,429:77-81.

　　［5］　Toso JF, Oei C, Oshidari F, et al. MAGE-1-specific precursor cytotoxic Tlymphocytes from a patient with breast cancer: characterization and antigen-specific activation. Cancer Res, 1996,56: 16-20.

　　［6］　Marchand M, Ven Baren N, Weynants P, et al. Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by MAGE-3 and presented by HLA-A1. Int J Cancer, 1999,80: 219-230.

　　［7］　Hoon D S B, Yuzuki D, Hayashida M, et al. Melanoma patients immunized with melanoma cell vaccine induce antibody responses to recombinant MAGE-1 antigen. J Immunol, 1995, 154: 730-737.

　　［8］　Hu X, Chakraborty NG, Sporn JR, et al. Enhancement of cytolytic T lymphocyte precursor frequency in melanoma patients following immunization with the MAGE-1 peptide loaded antigen presenting cell-based vaccine. Cancer Res, 1996, 56: 2479-2483.

　　［9］　Weber J, Salgaller M, Samid D, et al. Expression of the MAGE-1 tumor antigen is up-regulated by the demethylating agent 5-aza-2′-deoxycytidine. Cancer Res, 1994, 54: 1766-1771.

　　［10］　Ishida M, Matsumura T, Salgaller M, et al. MAGE-1 and MAGE-3 or-6 expression in neuroblastoma-related pediatric solid tumors. Int J Cancer, 1996, 69: 375-380.

收稿日期：1999-04-15