肺癌组织端粒酶活性的定量研究及其临床意义

中国肺癌杂志 2000年第2期第3卷 论　著

作者：陈蔚蔚　周宏远　周清华　熊小熊　张洁

单位：陈蔚蔚　周宏远　周清华　熊小熊　张洁(610041　成都，华西医科大学附属第一医院肿瘤中心　肿瘤研究所)

关键词：肺肿瘤；端粒酶；TRAP-PCR

　　【摘要】　目的　研究肺癌组织中端粒酶活性的表达及其临床意义。方法　采用定量放射端粒重复序列扩增法(TRAP)检测74例肺组织中(45例为NSCLC，15例SCLC，结核7例，炎性假瘤7例)端粒酶的活性。结果　NSCLC端粒酶阳性率为73.3％，且活性较弱(172TPG)，SCLC端粒酶的阳性率为93.3％，且活性较强(288TPG)。结核与炎性假瘤端粒酶活性全为阴性。SCLC端粒酶活性显著高于NSCLC(P＜0.05)，且酶的活性水平与肺癌组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有密切关系(P＜0.05)。结论　端粒酶可能是判断肺癌预后不良的指标之一。

A study on the telomerase activity in lung cancer and its clinical significance

CHEN Weiwei, ZHOU Hongyuan, ZHOU Qinghua, XIONG Xiaoxiong, ZHANG Jie. Cancer Center and Cancer Institute, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041,P.R.China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the telomerase activity in human lung cancer and its clinical significance. Methods　Sixty human lung cancer specimens (NSCLC 45, SCLC 15), seven tuberculosis specimens and seven inflammatory pesudotumor were examined for telomerase activity by means of TRAP (telomeric repeat amplification protocol) based on polymerase chain reaction. Results　In NSCLC, telomerase positivity was 73.3％(33／45) with weak to moderate activity (172TPG), whereas 14 of 15 SCLC (93.3％) were positive with strong activity (288TPG), and all tuberculosis and inflammatory pseudotumor were telomerase negativity. The telomerase activity was significantly higher in SCLC than that in NSCLC (P＜0.05), and was closely associated with the differentiation, size of the cancer, lymph node metastasis, and TNM staging (P＜0.05). Conclusion　The results suggest that telomerase may be regarded as one of the prognostic factor in lung cancer.

　　【Key words】　Lung neoplasms　　Telomerase　　TRAP-PCR

　　癌细胞永生化是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一。自Kim建立TRAP-PCR端粒酶活性检测技术以来，肿瘤细胞永生化的“端粒-端粒酶”假说已被越来越多的实验所证实。端粒酶是目前发现的一个广谱肿瘤标志，85％以上的肿瘤有端粒酶的表达。国外报道多数肺癌细胞中均有端粒酶的激活^［1］，国内此方面报道较少。本研究应用定量放射端粒重复序列扩增法(TRAP)检测60例肺癌组织中端粒酶活性的表达，并以14例良性肺部病变肺组织作对照，以揭示端粒酶活性与肺癌发生发展及临床病理生理特征之间的关系，并探讨端粒酶在肺癌的诊断与治疗中的临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源　74例肺组织手术切除标本均由华西医科大学附属第一医院胸外科提供。标本于术后0.5h内获得，并立即置于液氮中保存。其中男43例，女31例，平均年龄57岁。术前患者均未接受任何治疗。经病理学诊断，NSCLC45例，SCLC15例，结核瘤7例，炎性假瘤7例。

　　1.2　端粒酶提取　端粒酶检测试剂盒购自Onco Inc。所有步骤均严格按药盒说明书操作。取50～100mg组织标本，液氮碾磨，PBS冲洗2次，离心弃上清，加200μl预冷的端粒酶裂解液(10μmol／L Tris-HCl，pH7.5，1μmol／L MgCl₂，1μmol／L EGTA，0.1μmol／L PMSF，5μmol／L β-巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％甘油)混匀，置于冰上孵育40min，14000r／min，离心30min，取上清并分装成2管，一管置于－80℃冰箱冻存，另一管用考马斯亮兰G-250测其蛋白质浓度，以1mg／ml为标准反应浓度。

　　1.3　端粒酶活性检测　采用改良的TRAP-PCR方法检测端粒酶的活性，25μl反应体积内含TRAP Buffer，dNTP，³²P-TS引物，RP引物及36bp内对照的K1引物及其模板TSK，Taq酶，组织端粒酶提取液，30℃保温30min进行引物延伸，94℃30s，52℃ 40s，72℃ 90s，35次循环，最后置于72℃延长10min。PCR产物在12.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳后凝胶与X光片置于－80℃放射自显影，12h后显示结果。在X光片上显示出间隔6bp的梯形条带者为端粒酶阳性。

　　1.4　凝胶成像和扫描分析　在UVP-GDS-8000凝胶成像系统上对X光片的梯形条带灰度进行扫描，其密度值按药盒提供的公式计算，端粒酶的活性以TPG为单位，每一单位TPG代表1×10^－3amole或600个分子TS引物在30℃每10min至少扩增3段端粒重复序列。

　　1.5　统计学处理　阳性率的比较采用χ²检验，TPG均值比较采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　肺癌组织中端粒酶活性的定性分析　放射性自显影后的X光胶片上出现间隔6bp梯形带为端粒酶阳性，仅有36bp内对照条带的为端粒酶阴性(图1)。

图1　肺癌组织中端粒酶活性的表达

　　M：标准分子量 PBR322／HaeⅢ；1～7、9、10：端粒酶阳性；8：端粒酶阴性

　　Fig 1　Telomerase expression in lung cancer tissues

　　M: Marker；1～7、9、10：Positive；8：Negative

　　2.2　端粒酶活性与肺癌临床病理生理特征间的关系(表1)

表1　端粒酶活性与肺癌临床病理生理特征的关系

　　Tab 1　The relationship between telomerase activity and clinical pathophysiological characteristics of lung cancer

　　P₁：comparison between positive rate of different groups；P₂：comparison between TPG of different groups2.2.1　端粒酶的阳性检出率　60例肺癌组织中47例表现为端粒酶阳性(78.3％)，而14例结核及炎性假瘤组织中均未检出端粒酶活性。经统计学处理，端粒酶的阳性检出率与肺癌组织学类型、原发肿瘤大小、淋巴结转移，以及病理分期均无明显关系(P均＞0.05)。在不同分化程度的肺癌组织中，分化程度越低，端粒酶阳性检出率越高(P＜0.05)。

　　2.2.2　端粒酶的活性水平　经统计学分析发现，端粒酶活性的高低与肺癌病理组织类型、原发肿瘤大小、淋巴结转移、细胞分化程度及病理分期均有密切关系(P均＜0.05)。SCLC的端粒酶活性显著高于NSCLC；肿瘤体积较大者比较小者端粒酶活性水平更高；有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者；低分化癌高于高分化癌；Ⅲ、Ⅳ期肺癌高于Ⅰ、Ⅱ期肺癌。

　　3　讨论

　　端粒可能是细胞有丝分裂的计时钟(mitotic clock)。随着细胞的每一次分裂，端粒DNA不断丢失而缩短，当其缩短到一定长度，可触发某种信号，使细胞进入第一致死期M1，从而退出细胞周期而死亡；如果细胞被病毒转染，或者某些抑癌基因如p53、Rb突变，细胞可越过M1期而继续分裂，端粒继续缩短，当达到一定阈值时，细胞进入第二致死期M2，此时染色体可能出现形态异常，大多数细胞由于端粒太短失去对染色体的保护功能而死亡；但极少数细胞在此阶段进一步激活端粒酶，从而逃避死亡，具有无限增殖能力。端粒酶是一种特殊的核糖蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的活性，能以自身的RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使缩短的端粒得以延长，从而恢复端粒功能，导致细胞永生化。

　　研究表明，端粒酶广泛地存在于各种癌组织中，说明端粒酶活性与恶性肿瘤之间有较高的相关性。Hiyama等^［2］研究了48例NSCLC，发现其端粒酶阳性率为73％，而SCLC中端粒酶阳性率为100％。本研究检测45例NSCLC中的端粒酶活性，33例表达端粒酶活性，阳性率为73.3％；15例SCLC中，14例端粒酶阳性(93.3％)，与上述文献报道相似。关于肿瘤组织中端粒酶活性的高低与病理组织类型、分化程度和预后的关系尚无明确的结论。Hiyama等^［3］在胃癌研究中发现端粒酶的活性与淋巴结转移、肿瘤大小有关，但有的学者却认为端粒酶与临床病理类型及预后均无统计学相关性，这可能与肿瘤类型不同有关。我们在对35例鼻咽癌端粒酶活性的研究中发现，端粒酶活性的高低与病理组织类型有关，而与临床分期无关。本研究观察到端粒酶活性的高低与肺癌病理组织类型、原发肿瘤大小、淋巴结转移、细胞分化程度及病理分期均有密切关系，晚期、伴有淋巴结转移、低分化癌、肿瘤体积较大者端粒酶活性表达增高更明显，SCLC端粒酶的活性显著高于NSCLC，说明端粒酶活性高低与肺癌的恶性程度具有一致性。上述结果表明端粒酶活性高者其预后可能较差，端粒酶可能是肺癌预后不良的指标之一。

　　Sharma提出对于多数实体瘤而言，只有当DNA突变累积到一定程度时，端粒酶方能再激活。研究已证实大多数肺癌组织中出现了3号染色体短臂(3p)上某些遗传物质的丢失^［4］，另一些资料表明3p上存在端粒酶活性的抑制因子。肺癌中3p遗传物质的丢失是否包含端粒酶活性抑制因子还须进一步研究。myc癌基因已被证实可以活化端粒酶，而肺癌组织中常见myc家族基因的扩增和过度表达。由于肿瘤的形成是一个多阶段、多基因参与的过程，肿瘤细胞中端粒酶的调控机制还有待更深入的研究。

　　肺癌的综合治疗疗效迄今还不十分令人满意，研究端粒酶与肺癌的关系有助于寻找端粒酶的抑制剂，为肿瘤治疗开辟新的途径。反义核苷酸、核酶、核苷类似物、蛋白激酶C抑制剂等作为端粒酶抑制剂显示出极有潜力的应用价值。但是，在正常人类生殖细胞以及造血干细胞中也有端粒酶活性，因而端粒酶抑制剂对这些具有再生能力的细胞可能产生毒副作用。此外，肺癌中并非所有端粒均缩短。严军等^［5］研究了42例肺癌患者端粒长度变化，发现29例明显缩短，6例几乎未变，7例延长，部分肿瘤细胞也具有较长的端粒。因此，端粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。

　　端粒、端粒酶与肿瘤的密切关系，使端粒酶成为当今肿瘤防治领域最受重视的新靶点。相信随着研究的深入，端粒酶研究成果将被应用于临床，为治愈肿瘤作出重要贡献。

　　本研究受国家自然科学基金(39570392)资助

参　考　文　献

　　1，Ahrendt SA, Yang SC, Wu L, et al. Comparison of oncogene mutation detection and telomerase activity for the molecular staging of non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res,1997,3(57)∶1207-1214.

　　2，Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancers. J Natl Cancer Inst,1995,87(12)∶895-902.

　　3，Hiyama E, Yokoyame T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995, 55(15)∶3258-3262.

　　4，Gazdar AF, Carbone DP. The biology and genetics of lung cancer. Austin RG landes company,1994.

　　5，严军，周宏远，肖林，等.人肺癌染色体端粒行为异常与癌变的关系.四川大学学报(自然科学版)，1998，35(专辑)∶72-75.

(收稿：1999-08-05　　修回：1999-12-24)