人非小细胞肺癌组织p73基因转录表达研究

中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 肺癌分子生物学研究

作者：何勇　范士志　蒋耀光　陈建明　李志平　张华

单位：何勇　范士志　蒋耀光　陈建明　李志平　张华(第三军医大学大坪医院野战外科研究所胸心外科　重庆，400042)

关键词：p73基因；肺肿瘤；过度表达；PCR

　　【摘要】目的　探讨p73基因转录表达与肺癌发生、发展的关系。方法　采用逆转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)检测32例非小细胞肺癌组织、癌旁组织和7例肺良性病变组织，及其对应正常肺组织p73 mRNA的表达。结果　32例肺癌组织中28例p73表达明显升高，肺癌组织中p73 mRNA阳性表达率明显高于癌旁肺组织和肺良性病变组织(P＜0.01)。肺癌组织中p73 mRNA的阳性表达率与组织学类型、细胞分化程度和P-TNM分期无明显关系(P＞0.05)。结论　肺癌组织中存在p73基因的过度转录表达，它可能参与调控非小细胞肺癌的发生、发展过程。

Study on the transcript expression of p73 gene in human non-small cell lung cancer tissues

HE Yong,FAN Shizhi,JIANG Yaoguang,CHEN Jianming,LI Zhiping,ZHANG Hua.

　　(Department of Thoracic Surgery,Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing 400042，P.R.China

　　【Abstract】Objective　To explore the relationship among the p73 gene transcript expression and the oncogenesis,development of human non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods　The expression of p73 mRNA was detected in 32 human NSCLC tissues,para-cancer tissues,7 lung benign lesion tissues and matched non-cancer lung tissues by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).Results　Overexpression of p73 mRNA was found in 28／32 NSCLC tissues.The positive expression rate of the p73 mRNA in the cancer tissues was significantly higher than that in the para-cancer tissues and benign lesion tissues either (P＜0.01).No significant relationship was observed among p73 expression and differentiated grades,histoclassification and P-TNM stages of the cancer (P＞0.05).Conclusion　The results suggest that there is an overexpression of p73 mRNA in lung cancer tissues and it may paly an important role in the tumorigenesis and development in NSCLC.

　　【Key words】p73 gene　　Lung neoplasms　　Overexpression　　PCR

　　p73是近来发现的p53基因家族的新成员，其产物与p53蛋白具有非常相似的结构和功能，被认为是一个候选抑癌基因^［1，2］。目前，有关肺癌组织中p73基因的转录表达研究，国内外均仅有少数报道。本研究应用逆转录多聚酶链反应技术(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)，对32例非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织、癌旁组织和7例良性病变肺组织的p73 mRNA表达水平进行分析，并以相同病例的远癌肺组织作对照，以探讨p73基因转录表达水平改变与肺癌发生、发展的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象　全部标本取我科和重庆医科大学附一院胸心外科1999年1月至4月住院患者的手术切除肺组织，并经病理学检查确诊。肺癌患者32例，肺良性疾病患者7例。肺癌病例中，男23例，女9例；年龄41～72岁，平均57.5岁；其中鳞癌17例，腺癌13例，腺鳞癌2例；病理分期采用1997年UICC肺癌国际分期标准，ⅠA＋ⅠB期10例，ⅡA＋ⅡB期13例，ⅢA＋ⅢB期9例。肺良性疾病中男3例，女4例，年龄48～62岁，平均53.7岁；炎性假瘤5例，结核2例。

　　1.2　组织标本　全部标本均在手术时收集，取材后立即放入液氮待检。肿瘤均在原发灶取材；癌旁组织取自相应肿块旁2?cm，远癌肺组织取自距肿块5?cm以上之肺组织，并经病理学检查未见癌细胞。

　　1.3　引物　参照Ming Mai^［3］的序列合成一对p73基因的引物，由美国Mayo研究所Wanguo Liu教授合成后惠赠。引物序列：上游引物：5′-AACGCTGCCCCAACCACGAG-3′；下游引物：5′-GCCGGTTCATGCCCCCTACA-3′。PCR产物片段为231?bp。为保证逆转录效率和确定cDNA的完整性，将β-actin做为参照。β-actin引物购自英国Stratagene公司，PCR产物片段为661?bp。

　　1.4　实验方法　组织总RNA的提取采用Tripure分离试剂(B.M公司)，按试剂盒说明书操作。用紫外分光光度计定量，计算吸光度(A)值260与280比值，检测RNA的纯度，比值均在1.80以上。经1％琼脂糖甲醛变性凝胶电泳，可见有28S和18S两条清晰的rRNA电泳条带。

　　应用AMV-RTase和0ligo(dT)15引物(均为Promega公司产品)，先将以上所提取的总RNA反转录成cDNA。PCR扩增反应：取4?μl反转录cDNA作PCR扩增，反应体系为20?μl，含10×PCR buffer 2?μl，Mg^2＋ 2?mmol／L，dNTP各200?μmol／L，Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer公司) 0.5?U，引物各0.3?μmol／L。并按以下参数在PCR扩增仪(Perkin-Elmer公司9600型)上进行。p73反应条件：95℃变性60?s，60℃退火60?s，72℃延伸90?s，经33个循环周期后，取10?μl PCR产物经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳、溴化乙锭染色后，紫外灯下观察结果，照相。以PCR-Marker为标准，在231?bp位置出现条带为p73表达阳性。β-actin反应条件：94℃变性70?s，60℃退火70?s，72℃延伸115?s，经35个循环周期后，1.5％琼脂糖凝胶(含0.5?mg／L溴化乙锭)电泳，在661?bp位置出现条带为β-actin表达阳性。

　　1.5　结果判断^［3］　阴性结果只有661?bp位置的β-actin内标带出现，阳性结果除内标带外尚有p73基因231?bp的阳性带。将底片置密度扫描仪下分析，以两条带的积分吸光度比值反映p73基因的相对表达。根据p73／β-actin大小判断p73表达水平高低，p73／β-actin＜0.1时为阴性，＞0.1为阳性，病变组织p73／β-actin大于对应正常肺组织为过量表达。

　　1.6　统计学处理　计数资料采用χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　PCR扩增(图1、2)　32例肺癌组织中28例p73表达阳性，癌旁组织中5例表达阳性，远癌肺组织4例表达阳性。肺癌组织和癌旁组织中p73过量表达者分别为28例和2例。7例良性病变肺组织及其对应正常肺组织均未见阳性表达(表1)。

　　2.2　肺癌组织、癌旁组织、良性病变肺组织中p73转录表达比较　以β-actin作内参照，肺癌组织与癌旁组织、良性病变肺组织及对应正常肺组织之间p73 mRNA阳性表达率具有非常显著差异(P均＜0.01)，而后三者之间p73 mRNA表达无显著差异(P＞0.05)(表1)。

表1　不同肺组织中p73表达的比较

　　Tab 1　Comparison of p73 expression in the

　　different pulmonary tissues

图1　RT-PCR分析β-actin的表达，作为p73基因表达的参照

　　M：DNA分子量标志；T：肺癌组织标本；N：远癌肺组织标本

　　Fig 1　RT-PCR analysis of β-actin expression in different lung tissues

　　It was used as an internal control.M:Markers;T:Lung cancer tissues;N:Non-cancer lung tissues

图2　RT-PCR分析p73表达

　　M：DNA分子量标志；T：肺癌组织标本；N：远癌肺组织标本

　　Fig 2　RT-PCR analysis of p73 expression in different lung tissues

　　M:Markers;T:Lung cancer tissues;N:Non-cancer lung tissues

　　2.3　p73 mRNA表达与肺癌临床病理特征之间的关系　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期p73基因的表达率分别为90％(9／10)、84.6％(11／13)和88.9％(8／9)。肺癌不同细胞分化程度p73基因的表达率为：低分化90％(9／10)、中分化85.7％(12／14)、高分化87.5％(7／8)。鳞癌、腺癌和腺鳞癌p73基因的表达率分别为82.4％(14／17)、92.3％(12／13)和100％(2／2)。统计学分析表明，p73 mRNA阳性表达率与TNM分期、细胞分化程度及组织学类型无明显关系(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，并且与肺癌尤为相关，大约50％的NSCLC和70％的SCLC都有p53基因突变。p53作为经典的抑癌基因具有“基因组卫士”的作用，能通过调控p21^Waf-1等靶基因而引起细胞周期停滞及细胞凋亡。p73不但结构与p53具有高度的同源性，而且能象p53一样调控细胞周期进程及诱导细胞凋亡^［2］。p73基因定位于染色体上一个在多种人类肿瘤中发生缺失频率非常高的区域——1p36.33^［4］，目前认为p73基因就是该区一个极具希望的候选抑癌基因。因此，p73一被发现便成为肿瘤分子生物学和遗传学领域的一个研究热点。但是，p73的生理功能以及在肿瘤中的作用等问题均有待进一步研究。

　　目前，p73在一些肿瘤如神经母细胞瘤、膀胱癌、前列腺癌、大肠癌和脑膜瘤中的转录表达研究国外已有报道，但结果不太一致。研究发现在神经母细胞瘤^［5］、脑膜瘤^［6］和前列腺癌^［7］中p73 mRNA的表达并不升高，而在大肠癌、乳腺癌^［8］和膀胱癌^［9］中p73 mRNA的过量表达却十分明显。Senoo^［10］认为，p73 mRNA在不同肿瘤中明显的表达差异提示p73的作用或许具有组织特异性。本研究以组织学分型、分化程度及临床TNM分期为基础，比较了人NSCLC各组间p73基因的阳性表达率，发现差异均无显著性意义(P＞0.05)，提示p73的表达是独立于上述临床病理学特征之外的分子参数。本研究观察到，肺癌组织中p73 mRNA表达水平较良性病变肺组织有明显升高，提示肺癌中确实存在p73的过度转录表达，p73基因可能参与调控肺癌的发生。此外，肺癌中p73的转录表达较癌旁肺组织和远癌肺组织明显增高，癌旁组织虽发现有2例过量表达，但与远癌肺组织间无统计学差异，且两例过量表达者不排除因癌旁组织距肿瘤过近取材受污染或存在普通病检未发现的肿瘤细胞浸润。这一观察结果提示p73过量表达可能是肺癌发生过程后期才发生的分子事件，与Ichimiya^［8］对神经母细胞瘤的研究结果较一致。或许可以推测，对于正常肺组织来说，p73基因是一种肿瘤防御或应激基因，只有当组织发生癌变才能触发p73基因应激性地增强表达，执行其防御功能，这有利于解释p73的表达特点与其功能的关系。

　　迄今，在已检测的细胞株和人类肿瘤如肺癌、前列腺癌、大肠癌和膀胱癌等肿瘤中均未发现p73基因的突变^［11］，研究者认为：p73在肿瘤发生机制中或许并不象p53一样是一个抑癌基因^［12］。但Jack认为即使p73并非抑癌基因，但如能找到一个方法开启p53缺失的肿瘤细胞中p73基因的功能，将使癌症治疗成为可能^［13］。有关p73是不是一种抑癌基因、p73在肿瘤中为什么很少突变、它的活化调节机制以及与p53的关系都有待进一步研究。

　　本课题受重庆市应用基础基金(99-5658)资助

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收稿日期：1999-09-05

修回日期：2000-01-06