肺癌标志物芳烃羟化酶的临床应用意义探讨

　　中华结核和呼吸杂志2000年第23卷第3期

陈良安　刘又宁

　　 摘要　目的:寻找较为理想的肺癌标志物，为肺癌的早期诊断提供帮助。方法:采用荧光分光光度仪对51名正常人、30例良性肺病患者及93例不同病理分型、不同分期的肺癌患者（腺癌30例，鳞癌30例，小细胞癌33例；Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者35例，Ⅳ期患者30例）外周血淋巴细胞芳烃羟化酶(AHH)活性及变化进行了观察并与癌胚抗原(CEA)进行了对比。结果:肺癌患者外周血淋巴细胞AHH活性为(4.9±2.1) pmol·min^-1.10^-6细胞，其中鳞癌患者、正常人和良性肺病患者分别为(7.3±1.9)、(1.1±0.7)和(1.2±0.6) pmol·min^-1.10^-6细胞，提示肺癌患者外周血淋巴细胞AHH活性显著高于正常人及良性肺病患者，尤以鳞癌为著。此外，Ⅰ、Ⅱ期患者外周血淋巴细胞AHH活性为(3.7±1.4) pmol·min^-1.10^-6细胞，Ⅲ期患者为(5.1±2.1) pmol·min^-1.10^-6细胞，Ⅳ期患者为(7.1±1.8) pmol·min^-1.10^-6细胞，而且，病情恶化时AHH活性升高，病情改善时AHH活性降低。诊断评价提示：AHH灵敏度和特异性均在80%以上，对鳞癌的灵敏度达90%以上。AHH对肺癌相对危险度为2.83。结论:AHH是一个较为理想的肺癌标志物，尤其对肺鳞癌有较好的灵敏度和特异性，可用于肺癌的临床诊断、病情监测和预后估计。

　　 关键词：芳烃羟化酶　肺肿瘤

　　 近年来，肿瘤标志物的研究进展迅速。其中许多标志物已应用于临床，为某些肿瘤的早期诊断提供了有效的手段。但目前还未能发现较满意的肺癌标志物，尤其是肺鳞癌的特异性和灵敏度较好的标志物尚为空白。为此,我们在国内首次建立了外周血淋巴细胞芳烃羟化酶(aryl hydrocarbon hydroxylase， AHH)的检测方法，并对其在肺癌的临床诊断应用进行探讨。

　　材料与方法

　　一、实验试剂与仪器

　　植物血凝素M、 美洲商陆和苯并芘由美国Sigma公司提供， 还原型辅酶Ⅰ、还原型辅酶Ⅱ为德国Gmbh公司生产，癌胚抗原(CEA)酶免疫试剂由北京生物制品所生产。铂金荧光分光光度仪由美国Abbore公司生产。

　　二、受试对象

　　健康对照51人，男性31人，女性20人，平均年龄(40±15)岁。良性肺病组(结节病3例、肺结核10例、结核性胸膜炎17例)共30例，男性18例、女性12例，平均年龄(43±10)岁。肺癌组共93例(均由病理证实)，男性50例，女性43例，平均年龄(42±12)岁。其中Ⅰ、Ⅱ期患者28例，Ⅲ期患者35例，Ⅳ期患者30例。腺癌患者30例，小细胞癌患者33例，鳞癌患者30例。

　　三、AHH活性的检测

　　受试者禁用一切药物及可能影响AHH的食物（如咖啡等）3 d，静卧8 h，凌晨7时空腹在无菌条件下，抽取前臂静脉血约10 ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。 置淋巴细胞于淋巴细胞培养液,于二氧化碳孵箱中孵育72 h。收获淋巴细胞，加入1 ml Tris-HCl缓冲液、80 mmol的苯并芘，于37℃水浴1 h后，用正己烷-丙酮混合物中止反应，充分振荡混合，离心10 min，取上相3 ml于另一试管。加入1 mol/L NaOH 2.5 ml，充分振荡混合后，离心10 min，取碱相用荧光分光光度仪测定荧光强度，并通过标准曲线推算出AHH活性。

　　四、CEA的测定

　　采血的同时取2 ml血于不抗凝试管中，取血清0.5 ml。CEA的测定方法为单克隆抗体法。

　　五、统计处理

　　将上述实验数据输入电子计算机进行统计学处理，所用软件包为美国SAS软件，分别采用F检验、Duneett t检验、t检验、卡方检验，P＜0.05时判断为差异有显著性，P＜0.01时则为差异有极显著性。

　　结果

　　正常人组、良性肺病组和肺癌组外周血淋巴细胞AHH活性及血清CEA含量的差异如表1。经F检验和Duneett t检验证实肺癌组AHH和CEA明显高于其它组，其中AHH较正常人组和良性病组分别升高335%和309%，正常人与良性肺病二组间无差异，肺癌组AHH明显高于其它组。

表1　三组受试者外周血淋巴细胞AHH活性及

血清CEA含量的比较（x±s）

注: 肺癌组与其它组比较^*P＜0.05,^△P＜0.01 　　不同分期肺癌患者外周血淋巴细胞AHH活性及血清CEA含量的差异如表2所示。AHH在Ⅰ、Ⅱ期已显著高于正常人组和良性肺病组,且随分期而升高。这一趋势在CEA不明显。

表2　各期肺癌患者外周血AHH和CEA含量的比较（x±s）

注:与正常人组比较^▲P＜0.05,^△P＜0.01；与良性肺病组比较^★P＜0.05,^☆P＜0.01 　　各组织类型肺癌外周血淋巴细胞AHH活性及血清CEA含量的差异如表3。AHH在鳞癌组升高最为明显，较正常人组和良性病组分别升高550%和511%，较小细胞癌组升高57%，较腺癌组升高76%，而CEA在腺癌组升高最为明显。

表3　各组织类型肺癌外周血淋巴细胞AHH及血清CEA含量的比较（x±s）

注: 与正常人组比较^▲P＜0.05,^△P＜0.01；与良性肺病组比较^★P＜0.05,^☆P＜0.01　　肺癌患者病情变化时，外周血淋巴细胞AHH活性亦改变(表4)。病情改善时AHH明显下降(P＜0.01),而CEA则不明显。病情恶化时，AHH和CEA均有不同程度升高(P＜0.05)。

　　我们以1.79 pmol·min^-1·10^-6细胞为AHH正常值，3.14 ng/ml为CEA正常值，并以此值进行诊断评价指标的推算:(1)AHH和CEA的诊断评价结果(表5)表明AHH在灵敏度、特异度、诊断符合率等诊断评价指标均明显优于CEA，如果两者合用,效果更好。（2）AHH和CEA在不同组织类型肺癌中的诊断评价结果(表6)表明AHH在鳞癌的灵敏度最高(P＜0.05)，而CEA在腺癌的灵敏度最高(P＜0.05)；AHH和CEA的特异度和假阳性率在各组间差异无显著性(P＞0.05)。

　　分析表明AHH升高发生肺癌的相对危险度(RR)为2.83，P＜0.05,而CEA仅为0.22，且差异无显著性(P＞0.05)。

表4　肺癌患者病情变化时外周血淋巴细胞AHH活性及血清CEA含量的变化（x±s）

　　 注: 病情改善指标为肺内病灶缩小1/3以上者，病情恶化的指标为肺内病灶增大或出现转移。就诊时与改善后或就诊时与恶化后比较，^**　P＜0.01，^*P＜0.05

表5　AHH和CEA的诊断评价及比较

　　注: AHH与各组比较，^▲P＜0.05,^△P＜0.01

表6　AHH和CEA在不同组织类型肺癌的诊断评价及比较

　　 讨论

　　一、AHH的生物学特性

　　AHH是广泛存在于人体各组织细胞内的一种单氧化酶。尤其在肝组织和肺组织含量较高，外周血淋巴细胞内亦有该酶的存在，其含量与肺组织含量有正相关关系^［1］。

　　AHH的主要生理功能之一就是参与苯并芘等多环芳烃的代谢活化。目前已证实以苯并芘为代表的多环芳烃与肺癌的关系密切^［2-5］：苯并芘等多环芳烃经AHH等酶的代谢活化后，产生数十种活化代谢产物。后者，与细胞的DNA、RNA、组蛋白等结合，导致细胞基因突变、癌变而发展为肺癌。因此，AHH活性越高，活化的致癌代谢产物的生成也就越多，肺癌的发生发展的可能性也就越大。从理论上表明AHH可作为一可靠的肺癌标志物。

　　二、肺癌患者外周血淋巴细胞AHH活性的变化

　　表1提示外周血淋巴细胞AHH活性在肺癌组显著高于正常人组和良性肺病组，其中肺癌组AHH活性较正常人组及良性肺病组分别升高335%和309%。而后二组之间差异无显著性。由于外周血淋巴细胞AHH活性与肺组织AHH活性有一定的正相关关系，我们推测肺癌患者肺组织AHH活性可能有不同程度的升高，如上所述AHH活性升高将促进肺癌的发生与发展。因此，临床上，在有一定病史的患者，AHH持续高水平则有助于肺癌的诊断。如果在已经明确的肺癌患者AHH居高不下，可能提示病变进展。此外, 表2表明在早期(Ⅰ、Ⅱ期)肺癌患者AHH活性已经显著高于正常人及良性肺病者，可见AHH有助于肺癌的早期诊断。

　　AHH活性在不同组织细胞类型的肺癌的升高程度是不一致的(表3)。其中鳞癌较正常人和良性肺病组高5倍以上，较腺癌和小细胞癌也升高57%～76%左右。AHH在腺癌组和小细胞癌组与正常人组和良性肺病组比较也有显著升高, 但不及鳞癌幅度大。提示AHH对鳞癌还具有一定的特异性。CEA则在腺癌升高幅度最为明显。因此，AHH对提高鳞癌的诊断有一定的意义。

　　三、AHH对肺癌监测和预后估计的意义

　　从表2可看出，随着病情进展，从Ⅰ、Ⅱ期到Ⅲ期、Ⅳ期，AHH活性呈进行性增高趋势，而CEA这一趋势不明显。表4也提示：病灶缩小时，AHH活性有显著性下降。病情加重时，AHH活性显著上升。这一变化幅度亦超过了CEA。可见AHH随病情变化而波动。Bartsch等^［6］也报告了AHH是肺癌预后估计的良好指标。因此，我们认为AHH活性的变化，对肺癌病情的判断、监测和预后估计具有一定的临床意义。

　　四、AHH的诊断评价

　　从表5可以看出，AHH的各项诊断评价指标均较满意,且优于CEA。提示AHH是一较好的肺癌标志物。此外，AHH的各项诊断评价指标在不同细胞类型存在着差异(表6)，对鳞癌最为敏感，小细胞肺癌次之，腺癌最差，而CEA正好相反。这些提示AHH对鳞癌具有相对特异性，有利于鳞癌的早期诊断，且与CEA、神经烯醇化酶等标志物有互补关系，联合使用效果更好。

　　五、AHH对肺癌的相对危险度

　　相对危险度分析表明AHH活性增高者发生肺癌为AHH正常者发生肺癌的2.86倍。因此，AHH不仅可作为肺癌标志物用于临床诊断和病情监测，也可用来发现高危人群，推测危险性的大小。如果AHH持续增高，则是一个危险信号，尤其是有吸烟或有多环芳烃接触史者，更有必要密切观察，以期早期发现、及时治疗。许多国外学者亦持有同样观点^［7，8］。

　　综上所述, AHH可作为较好的肺癌标志物,它不仅具有较高的灵敏度和特异度, 且对鳞癌有相对特异性, 可用于包括鳞癌在内的肺癌的早期诊断。同时, AHH与CEA、神经烯醇化酶存在互补关系, 联合使用, 意义更大。此外, AHH还可用于肺癌的病情监测、预后估计及高危人群监测。

　　作者单位：陈良安(100853 北京，解放军总医院呼吸科)

　　 　刘又宁(100853 北京，解放军总医院呼吸科)

　　 参考文献

　　1 Karki NT, Pokela R, Nuitinen L, et al. AHH in lymphocytes and lung tissue from lung cancer patients and controls. Int J Cancer, 1987, 39:565-567.

　　2 Sato S, Tomita I . Response differences among mouse strains in DNA damage and skin carcinogenicity of 7,12-dimethylbenz［a］anthracene are due to inducible aryl hydrocarbon hydroxylase activity. Biol Pharm Bull, 1998, 21:90-92.

　　3 Peluso M, Merlo F, Munnia, A et al. ³²　P-postlabeling detection of aromatic adducts in the white blood cell DNA of nonsmoking police officers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 1998,7:3-11.

　　4 Pelkonen O, Nebert DW. Metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: etiologic role in carcinogenesis. Pharmacol Rev, 1982, 34:189-222.

　　5 Conney AH. Induction of microsomal enzymes by chemical and carcinogenesis by PAH. Cancer Res，1982,42:4875.

　　6 Bartsch H, Hietanen E, Giuntini C. Possible prognostic value of pulmonary AH-locus-linked enzymes in patients with tobacco-related lung cancer. Int J Cancer, 1990,46:185.

　　7 Kiyohara C, Hirohata T. Environmental factor and aryl hydrocarbon hydroxylase activity in human lymphocytes. J Epidemiol, 1997,7:244-250.

　　8 Scherer G, Richter E. Biomonitoring exposure to environmental tobacco smoke: a critical reappraisal. Hum Exp Toxicol, 1997, 16:449-459.