细胞周期蛋白D₁基因表达与非小细胞肺癌生物学行为的关系

　　第二军医大学学报1999年第20卷第12期

　　谢宝松　李强　刘忠令

　　摘　要　目的：探讨非小细胞肺癌中细胞周期蛋白D₁（cyclin D₁）的表达与肿瘤生物学行为的关系。方法：采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌手术标本进行cyclin D₁ 检测，并结合临床随访资料作结果分析。结果：cyclin D₁阳性表达率为54.3 % （25/46），但与年龄、性别、TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关性（P＞0.05）；临床随访资料显示，在cyclin D₁ 基因表达阳性的25 例患者中有10例发生远处转移，而cyclin D₁表达阴性的21例中，仅1例发生远处转移，二者差别显著（P＜0.05）。进一步分析还发现，随着cyclin D₁阳性表达程度的增高，发生转移的机率也增大，表达中度阳性（++）的患者其转移发生率明显高于阴性（-）者（P＜0.05），而表达强阳性（+++）者与阴性（-）者比较，其转移发生率差异非常显著（P＜0.01）。结论：非小细胞肺癌cyclin D₁过度表达与肿瘤是否发生远处转移有关；检测 cyclin D₁的表达有助于判断预后并指导治疗。

　　关键词：非小细胞肺癌　细胞周期蛋白类　预后

　　细胞周期蛋白D₁(cyclin D₁)基因是新近发现并被公认的原癌基因，定位于染色体11q13^［1］,其编码的蛋白产物cyclin D₁是细胞进入细胞周期合成的第一个细胞周期蛋白，主要在细胞周期G₁→S关卡点中发挥正性调控作用，促进细胞增殖。本实验采用免疫组织化学EnVision二步法对46例非小细胞肺癌患者手术标本进行cyclin D₁的检测研究，以探讨cyclin D₁基因表达与非小细胞肺癌生物学行为间的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料　收集我院胸外科1990年1月至1994年6月间经病理证实的原发性非小细胞肺癌手术标本46例（术前未经放、化疗），术后随访均达5年以上。年龄36～69岁，平均（54.8±9.4）岁，男性38人，女性8人。术后5～26个月共有11例发生远处转移（骨转移4例，脑转移3例，肺转移3例，肝转移1例），其术前临床分期是Ⅰ_B期3 例，Ⅱ_B期1 例，Ⅲ_A期7 例。

　　1.2　方法

　　1.2.1　试剂　即用型cyclin D₁单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司（系美国Maxim生物公司产品）。EnVision试剂盒购自Dako公司。

　　1.2.2　免疫组织化学染色　（1）采用微波抗原修复技术，并按EnVision试剂盒说明书进行操作（EnVision二步法）。以已知的乳腺癌切片为阳性对照，用PBS替代一抗为阴性对照。（2）结果判断：以胞核或胞质呈现清晰的棕黄色为阳性。每例标本随机观察5个高倍视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，取平均值。根据阳性细胞数所占的比例分为：阳性细胞数少于5 %或看不到明显的阳性细胞者为阴性，示为“-”；阳性细胞数在5%～20%为弱阳性，示为“+”；阳性细胞数在 20%～50%为中度阳性，示为“++” ； 阳性细胞数大于50%者为强阳性，示为“+++”。

　　1.3　统计学处理　采用χ²检验。

　　2　结果

　　2.1　cyclin D₁的表达情况　46例非小细胞肺癌患者，25例(54.3%)cyclin D₁表达阳性。表达强阳性者胞核、胞质均有大量棕黄色颗粒分布(图1)。

图1　肺腺癌cyclin D₁强阳性的免疫组织化学染色

　　Fig 1　Strong positive cyclin D₁ immunostaining of lung adenocarcinoma (EnVision,×200)

　　A: Cytoplasmic staining；B： Nuclear staining

　　2.2　cyclin D₁表达与临床病理特征之间的关系　cyclin D₁过度表达与年龄、性别、组织类型、TNM分期及组织学分级均无显著性相关（表1）。

表1　cyclin D₁表达与临床病理指

　　标的相关性分析

　　Tab 1　Relative analysis of cyclin D₁ expression

　　and clinical and pathologic characteristics

　　2.3　cyclin D₁阳性表达与远处转移的相关分析　25例cyclin D₁阳性表达的患者，10例发生远处转移，而21例表达阴性的患者只有1例发生远处转移，转移率分别为40.0%和4.8%。表明cyclin D₁阳性表达与非小细胞肺癌发生远处转移有显著相关性（P＜0.05）。

　　2.4　cyclin D₁阳性表达程度与远处转移的关系　随着cyclin D₁阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加（表2）。统计学分析显示，表达中度阳性（++）的患者其转移发生率明显高于阴性（-）者（P＜0.05），表达强阳性（+++）者与阴性（-）者比较，其转移发生率差异非常显著（P＜0.01），而表达弱阳性（+）者与阴性（-）者之间的转移发生率无显著差异。可见cyclin D₁中度以上阳性表达与非小细胞肺癌的远处转移有密切关系。

表2　Cyclin D₁表达强弱与远处转移的关系

　　Tab 2　Relationship between the degree of cyclin D₁

　　expression and distant metastasis

M： Metastasis；^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs negative

　　3　讨论

　　哺乳类动物细胞周期中存在多个关卡点（check point） 调节各时相间的转换及细胞周期进程 ，其中以G₁→S关卡点最为重要。因为细胞一旦从G₁期跨入S期，则可以不再依赖外界信息刺激而很快自动完成分裂过程。而在目前已知的细胞周期蛋白中，cyclin D₁是调控这一关卡点最关键的蛋白。cyclin D₁可通过结合并激活细胞周期相关激酶CDK₄或CDK₆，引起底物Rb蛋白磷酸化，磷酸化后的Rb蛋白释放与之结合的转录因子E2F,导致DNA开始合成,促使细胞由G₁期进入S期。当cyclin D₁过度表达时，G₁→S期进程加速，造成细胞增殖失控而导致肿瘤的发生^［2］。

　　本研究结果， 非小细胞肺癌中cyclin D₁阳性表达率为54.3%,与国外报道的 50.0%左右相近^［3，4］,提示cyclin D₁过度表达参与了非小细胞肺癌的发生发展过程。

　　本研究还首次发现，cyclin D₁过度表达与非小细胞肺癌是否发生远处转移显著相关（P＜0.05），而且肿瘤发生远处转移的机率与cyclin D₁表达强弱有一定相关性, 即随着阳性表达程度的升高，远处转移发生率也随之增加，提示癌细胞的转移与细胞内基因调控有关。进一步分析还发现，11例术后发生远处转移的患者中有9例cyclin D₁表达呈中度以上阳性，其中有3例cyclin D₁表达呈强阳性者，其术前TNM分期仅为Ⅰ_B期, 但术后2年内却出现了骨转移、脑转移，这表明如果cyclin D₁呈现高表达，即使在肺癌早期，也要高度警惕远处转移的可能；同时也提示，在临床工作中遇到这种病例，术后应给予预防性化疗，以清除可能存在的微转移灶，并应加强随访。而cyclin D₁过度表达与非小细胞肺癌的TNM分期、组织类型及组织学分级均无相关，因此cyclin D₁表达可做为一项独立的预后指标并用于指导治疗。

　　另外，本研究结果还显示，cyclin D₁表达弱阳性（+）者与阴性（-）者之间的转移发生率无显著性差异。究其原因可能有两种：(1)cyclin D₁的过度表达存在一个由量变到质变的过程，当其达到一定量时，癌细胞的某些生物学特性才会发生改变；(2)样本量还不够大，影响了分组后的结果观察。其确切机制还有待进一步研究分析。

　　作者简介：谢宝松，男1970年10月生，硕士生

　　作者单位：第二军医大学长海医院呼吸内科，上海，200433

　　参考文献

　　1　Motokura T, Bloom T, Kim HG, et al. A novel cyclin encoded by a bcl-linked candidate oncogene［J］. Nature,1991,350(6318):512

　　2　Hortwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer［J］. Science, 1994, 266(5192):1821

　　3　Mate JL,Ariza A,Aracil C,et al. Cyclin D₁ overexpression in non-small-cell lung carcinoma: correlation with Ki-67 labelling index and poor cytoplasmic differentiation［J］. J Pathol,1996, 180(4):395

　　4　Betticher DC, Heighway J, Hasleton PS, et al. Prognostic significance of CCND₁(cyclin D₁) overexpression in primary resected non-small-cell lung cancer［J］. Br J Cancer,1996,73 (3):294