激光诱发荧光诊断早期肺癌的研究现状

　　中国激光医学杂志

　　cHINESE JOURNAL OF LASER MEDICINE & SURGERY

　　1999年第8卷第4期Vol.8No.4　1999

王伟　孙玉鹗　李峻亨

　　关键词：激光诱发荧光 早期肺癌 诊断

　　一、激光诱发荧光诊断肿瘤的基础

　　所谓激光诱发荧光(laser induced fluorescence, LIF)，即物质分子被激光激发后，一部分处于激发态的分子在下降到基态的过程中，以光子形式释放出它所吸收的能量的过程。因受激分子在由激发态下降到基态时损失了一部分能量，故荧光的波长即发射(emission)光波长总比激发(excitation)光波长稍长些。生物组织如癌组织与正常组织在某些物质含量上有差异，在受到适当波长的激光激发后，它们的荧光发射光谱就会存在差异，从而可根据荧光光谱形态和强度的不同来区分正常组织与癌组织，此即激光诱发荧光诊断肿瘤的基础。荧光可能来源于生物组织本身或存在于生物组织中的光敏物质。在不用外加光敏物质的条件下，生物组织受激发而产生的荧光是生物组织本质的反映，称为自体荧光，以此和外加光敏物质产生的荧光区别。肿瘤组织能选择性地较多吸收光敏物质并潴留之，而正常组织对光敏物质吸收较少且排泄较快，故在一定时间内，肿瘤组织中光敏剂的浓度高于周围正常组织；光敏物质被特定波长的激光激发后，能产生有一定波长的特征性的红色荧光，其强度明显高于自体荧光，从而更容易区分正常组织与癌组织。

　　二、LIF诊断肺癌的发展过程

　　1924年Policard首先在实验中观察到了肿瘤组织的自体荧光^［1］。40年代末Figge等^［2］发现血卟啉(hematoporphyrin)可被淋巴结、肿瘤、胚胎或创伤组织摄取，当被紫外线照射后，能产生一种明亮的桔红色荧光。1955年Rasmussen-Taxdal等^［3］给10例恶性肿瘤患者静脉注射500～1 000 mg的血卟啉，发现8例患者肿瘤部位有荧光。60年代Lipson等^［4,5］先后报道了50例支气管肺癌和食管癌患者的诊断结果，80%以上得到确诊，并首次提出了“荧光内窥镜检查法”的概念。80年代加滕治文等^［6］用此法对35例肺癌患者进行诊断试验，受试者静脉注射2.5～5.0 mg/kg的血卟啉衍生物(HpD)后48 h，用氪离子激光照射，结果在包括3例早期患者在内的33例患者的肺癌病灶上都看到了HpD的特征荧光。

　　随着医学科技的高速发展，1972年Baldes首先提出激光技术应用于荧光诊断在理论上是可行的^［7］。他认为泵浦染料激光可提供某一特定波长的高能量激发光，如337～348nm或400～410nm，这是激发HpD最理想的波长范围，并可避免以前由汞灯作为激发光源产生的有危害的热量和能量。具有活检通道的、可弯曲的纤维支气管镜的出现是气管镜诊断上的重大进展，为在体LIF的研究提供了必要的条件。它可解决激发光传导等一系列问题，并可在荧光出现处进行活体组织检查。70年代末光学多道分析仪(optical multichannel analyzer，OMA)的问世，使LIF的研究重新掀起了高潮。OMA能将荧光信号通过计算机处理转变为谱图的形式记录于监视器上。荧光强度不同，谱图波形、峰值也不同，由此通过对谱图的分析而鉴别肿瘤与正常组织。

　　三、肺癌荧光光谱图的特征和判断依据

　　随着LIF研究的深入及光动力疗法(PDT)的广泛应用，HpD光敏反应的副作用逐渐表现出来。解决的方法，一种是研制其他无光毒作用或皮肤光敏反应小的光敏剂；另一种是提高检查的灵敏度，即尽可能用较低剂量的光敏剂甚至不用光敏剂^［8,9］。不用光敏剂就是利用组织的自体荧光进行检查。有几种恶性肿瘤，单独依靠 组织自体荧光检查就可以区别，这主要是利用组织内源性卟啉和一些物质产生的红色荧光来进行的。国内一些作者于80年代末和90年代对胃癌等消化道肿瘤进行了激光诱发自体荧光光谱诊断，并测得了胃癌和结肠癌的特征峰^［10］。

　　肺癌的自体荧光光谱较复杂，研究结果不一。Hung等^［8］研究了一组病人的肺癌荧光光谱图，发现肺肿瘤比正常组织显示出较低的自体荧光强度。但Alfano研究小组^［9］对一组肺癌标本的研究结果显示正常组织和肺癌组织的荧光强度无明显差别，光谱随激发光波长的不同而形状不同。因此，肺癌与周围正常组织的自体荧光光谱虽然有差异，但无明显的特征峰，不足以进行肺癌的诊断，还需外加光敏剂提高荧光的对比强度。多数作者倾向于不用自体荧光对肺癌进行诊断，而建议使用光敏剂^［11,12］。

　　要用LIF诊断肿瘤，首先要找出正常组织与肿瘤组织荧光光谱的特异性差别。这种差别表现在光谱强度和形状、峰值位置、峰值变化速率、不同峰值间的比值等方面。目前认为较好的数据处理方法是不但测量最强荧光峰值，而且测量无光敏剂荧光的第二峰值（如560 nm以前的黄绿荧光），即用潴留在恶性组织中的光敏剂产生的红色荧光与组织发出的蓝绿色自体荧光的比值作为一种单位(arbitrary unit)来分析肺癌的光谱变化，从而作为肺癌的判断依据。这种方法有以下优点：它是一种无数值标准或无量纲（dimensionless）的比例单位，这种比例单位的结果对激发光探头与被激发组织的位置、距离、光源的波动等是不敏感的，从而可以排除仪器不协调或人为因素对诊断结果的影响^［13,14］。

　　由于肺癌的荧光受很多因素的影响，因此在用LIF诊断肺癌时，应根据具体使用的OMA装置、激光的种类、某一特定激发光波长、光敏剂的种类及剂量等方法和环境的不同，选用不同的荧光光谱、参数比值作为相应的判断依据。在确立判断依据后，实际诊断时要严格按照确立判断依据时观测荧光的所有条件进行荧光采集，当实验条件发生变化时，荧光会相应变化，必须重新确立判断依据，否则将会误诊。目前尚无统一的判断标准。

　　四、LIF诊断早期肺癌的研究进展及发展前景

　　90年代以来，随着PDT领域新药研究的进展，国内外在LIF方面的研究重点也转向第二代或第三代光敏剂方面上来。80年代以后，国外开始研制光敏素Ⅱ(Photofrin Ⅱ，DHE)，并逐渐代替了HpD^［1］。目前国外研究比较多的有氨基酮戊酸、酞菁类、苯并卟啉衍生物等。其中氨基酮戊酸研究很多，前景比较看好^［15-17］。氨基酮戊酸的一个很大优点是局部给药吸收较好。目前，氨基酮戊酸已经成功地应用于PDT和荧光诊断肿瘤。国内已经研究的有血卟啉单甲醚(HMME)^［18］及酞菁类^［19］，均有选择性肿瘤组织吸收浓度高、成分单一、光敏化作用强及避光时间短等优点。

　　福建师范大学激光研究所谢树森教授研究组自1991年首先在国内开展了LIF诊断早期肺癌的一系列基础研究。其研究填补了国内空白并为LIF诊断肺癌的进一步研究打下了基础。如光剂量学的初步研究，利用自行研制的光纤探针测量了人肺离体组织中的光分布，获得了肺组织光穿透深度的宝贵参数，并探讨了肺癌自体荧光与病理学的关系等^［20-22］。最近，他们又研制出利用红绿荧光之比进行LIF肺癌定位的比率检测系统^［23］，并准备进行肺癌诊断装置的临床前研究。

　　光敏剂-荧光作为诊断肺癌的一种新方法，它巨大的潜力或价值在于：(1)对痰癌细胞阳性而X线与气管镜检查阴性病人定位诊断；(2)对癌前期病变（重度非典型鳞状细胞增生）的定位诊断；(3)对原位癌的定位诊断；(4)对原发支气管肺癌在气管和支气管内转移性侵犯范围的检测，并根据侵犯范围，术前确定支气管切断水平；(5)对术后支气管内复发的诊断；(6)帮助确定活检部位等。

　　光敏剂-荧光诊断肺癌，还存在着假阳性和假阴性问题，即不能认为发生荧光区肯定就是癌，也不能完全排除非荧光区就肯定不是癌，故需要在荧光区取活检加以鉴别，因此目前LIF诊断肺癌还不能取代病理检查。

　　激光诱发荧光光谱诊断早期肺癌这项技术目前还处于临床试验阶段，许多方面还有待于进一步提高，如需进一步研制肿瘤组织选择性吸收高且荧光产生更强、副作用更小的第二、三代光敏剂；进一步提高激光器的发射能量，选择激光参数，以便能收集到较强的荧光信号；进一步改进OMA系统，将微弱信号放大加以区别；进一步改进光导纤维的导光性和韧性，使之更适用于气管镜下操作等。

　　LIF为早期诊断肺癌及其他恶性肿瘤开辟了一条新途径，有广阔和诱人的前景。相信随着现代高科技的进步，以上问题将逐步得到解决，最终LIF诊断肺癌能成为一种对肺癌高危人群的普查和诊断的常规方法。

　　作者单位：　解放军总医院(北京市，100853)　1.胸外科　2.激光科

　　参考文献

　　1　杨洪勤，张蕾. 光动力治癌新药卟吩姆钠的研究. 国外医药合成药生化药制剂分册，1998，19：32-34.

　　2　Figge FHJ, Weiland GS, Manganiello LO. Cancer detection and therapy: affinity of neoplastic, embryonic, and traumatized tissues for porphyrins and metalloporphyrins. Proc Exp Biol Med, 1948, 68:640-641.

　　3　Rasmussen-Taxdal DS, Ward GE，Figge FHJ. Fluorescence of human lymphatic and cancer tissues following high doses of intravenous hematoporphyrin. Cancer, 1955, 8:78-81.

　　4　Lipson RL, Baldes EJ, Olsen AM. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection. J Natl Cancer Inst, 1961, 26:1-12.

　　5　Lipson RL, Baldes EJ, Olsen AM. Further evaluation of the use of hematopophyrin derivative as an aid for endoscopic detection of malignant disease. Dis Chest, 1964, 46:676-79.

　　6　加滕治文，小中千守，小野寿太郎，他. 色素レ一ザ一によゐ診断と治療. 日本臨床外科，1982, 37：517-522.

　　7　Sanderson D, Fontana R, lipson R, et al. Hematoporphyrin as a diagnosis tool. A preliminary report of new techniques. Cancer, 1972, 9:1368-1371.

　　8　Hung MJ, Lam S, LeRiche JC, et al. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue. Lasers Surg Med, 1991, 11:99-105.

　　9　Tang GC, Pradhan A, Alfano RR. Spectroscopic differences between human cancer and normal lung and breast tissues. Lasers Surg Med, 1989, 9:290-295.

　　10　翟立平，李世荣，高革，等. 正常结肠和结肠癌的激光诱发荧光光谱. 中国激光医学杂志，1997, 6:132-135.

　　11　Anthony DJ, Profio AE, Balchum OJ. Fluorescence spectra in lung with porphyrin injection. Photochem Photobiol, 1989, 49:583-586.

　　12　Andersson-Engels S, Elner A, Joansson J, et al. Clinical recordings of laser-induced fluorescence spectra for evaluation of tumour demarcation feasibility in selected clinical specialities. Lasers Med Sci, 1991, 6:415-24.

　　13　Scheider DM, Wilson BC, Hassaram S, et al. Laser-induced fluorescence(LIF) for the detection of neoplasia in the esophagus. Gastroenterology 1995, 108(Suppl):A534.

　　14　Holstein CS, Nilsson AMK, Andersson-Engels S, et al. Detection of adenocarcinoma in Barrett's oesophagus by means of laser induced fluorescence. Gut, 1996, 39:711-716.

　　15　Jichlinski P, Forrer M, Mizeret J, et al. Clinical evaluation of a method for detecting superficial transitional cell carcinoma of the bladder by light-induced fluorescence of protoporphyrin Ⅸ following topical application of 5-aminolevulinic acid: preliminary results. Lasers Surg Med, 1997, 20:402-408.

　　16　Johansson J, Berg R, Svanberg K, et al. Laser-induced fluorescence studies of normal and malignant tumour tissue of rat following intravenous injection of δ-amino levulinic acid. Lasers Surg Med, 1997, 20:272-279.

　　17　Hong L, Shin DS, Lee YE, et al. Subcellular phototoxicity of 5-aminolaevulinic acid(ALA). Lasers Surg Med, 1998, 22:14-24.

　　18　陈文晖，许德余. 血卟啉单甲醚在荷瘤小鼠体内的分布. 第二军医大学学报，1990, 11:118-122.

　　19　李峻亨. 光动力疗法发展近况. 基础医学与临床，1997, 17:167-172.

　　20　谢树森，郑蔚. 荧光法定量肿瘤中的光敏剂浓度. 生物物理学报, 1991, 7:315-320.

　　21　谢树森，黄禄华，郑蔚，等. 人肺离体组织中光穿透深度的测量. 中国激光医学杂志，1995, 4:87-91.

　　22　谢树森，李峻亨，张其忠，等. 人肺肿瘤自体荧光与组织病理学类型的关系. 中国激光医学杂志，1995, 4:18-22.

　　23　林棋榕，谢树森，李步洪，等. 人肺组织氪离子激光荧光比率探测方法的研究. 中国激光医学杂志，1997, 6:136-140.

收稿日期：1998-10-12