p53与人类肺癌研究进展

国外医学内科学分册1999年第26卷第6期

中山医科大学孙逸仙纪念医院（510120） 张振峰 综述 张承惠 审校

　　摘要　p53基因是一种多功能的抑癌基因，近年来研究表明p53基因在人类支气管肺癌的发生、发展、转移、转归演化过程中发挥了重要角色。p53与肺癌关系的分子生物学和肿瘤发生学的深入研究为肺癌的基因诊断、基因治疗提供了科学依据，因而具有重大的临床应用价值。

　　关键词　p53；抑癌基因；肺癌；基因诊断； 基因治疗

　　支气管肺癌对人类的危害众所周知，正成为我国威胁最严重的恶性肿瘤及我国居民的主要死亡原因。肺癌也是一种基因遗传病，其发生根本原因在于细胞基因组DNA的损伤，导致细胞癌基因的激活或过分表达，抑癌基因（tumor suppressor gene,TSG）的丢失或其产物的失活，或两者兼而有之，引起细胞无限制生长而形成恶性肿瘤。在肺癌中，激活的癌基因组为myc和ras癌基因家族，抗癌基因为Rb和p53基因。TSG对防止细胞癌变有着重要作用，Minna等^[1]从分子病理学角度研究出发，提出了肺癌的演变是一系列分子变异的模式，其中p53基因突变是肺癌发生的重要关键基因之一，深入研究p53基因突变对于了解肺癌的发生发展具有重要的意义。

　　p53基因与肺癌的发生发展

　　p53的结构和功能　p53定位于人类17 p13.1染色体上，全长约16-20 kb,由11个外显子和10个内含子组成，其编码产生是393个氨基酸组成，分子量53 d，是与核DNA结合的磷蛋白。p53基因的一级结构已基本清楚，含有三个结构区：一个酸性的氨基末端区（276-390个氨基酸）和一个中部区。其中部区能直接与DNA结合，绝大多数肿瘤中检查到的p53点突变即发生在该区域中。p53基因具有转录因子的特性，参与细胞内众多的生理和病理过程。p53的不同功能取决于与p53作用的细胞或病毒蛋白。目前对p53生理功能研究最多的有两种：一种是抑制细胞分裂，让其停留在细胞周期的GI期；另一种是使细胞凋亡。

　　p53基因异常与肺癌　在人类肿瘤发生过程中，p53基因监控功能的丧失是目前最常检查到的变化之一，是肿瘤发生中最常见最重要的原因，也是迄今临床发现与肿瘤发病相关性最高的TSG^[2]。在大约200多种不同的恶性肿瘤中，有60%以上的肿瘤带有p53基因突变，大约50%的肺癌存在着p53基因的突变。Takahashi等^[3]研究发现，肺癌中p53遗传异常包括纯合子缺失及伴随点突变所致mRNA大小的改变，这些突变位于p53基因的阅读框架上，并在高度保守区改变了p53蛋白的氨基酸顺序（G→T），p53基因的突变集中于密码子132-285之间，因此p53基因突变是肺癌中发生频率最高的遗传改变，p53失活对肺癌的产生起重要作用。Marchetti等^[4]研究认为95%-98%的p53基因位于5、6、7、8四个外显子的相对保守区域内。

　　p53蛋白量表达受DNA损伤的影响很大，大多数抗癌药物属DNA损伤剂，p53基因的功能和肿瘤对某种特定抗癌药物的反应关系密切。p53基因功能的丧失与肿瘤的恶性程度相关，含有突变型，无活性p53基因的肿瘤，侵袭性最强，往往治疗难奏效，预后很差。由于p53基因与肿瘤治疗、预后的重要关系，对p53基因基本功能的检测有助于设计治疗方案^[2]。但Quantin等^[5]用抗人p53蛋白抗体PAb1801的间接免疫氧化物酶反应来检测84例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的p53蛋白积累与NSCLC手术后生存率关系，认为p53蛋白积累并不影响患者生存率的单变量或多变量分析。此外。Rosenfeld等^[6]研究小细胞肺癌（SCLC）患者血清中抗p53蛋白抗体与其预后的关系认为抗p53抗体测量结果与患者临床表现及预后并无相关性，因而并不是一个有用的预后指标。到底结果如何，尚须更多的临床研究进一步证实。

　　p53基因与肺癌的基因诊断

　　癌基因的激活和/或抑癌基因的失活将捉进肿癌的发生发展，在不同肿瘤中这两类基因所起作用不同，发生异常变化的这两类基因的构成谱系均不完全相同，可以利用这些活化的癌基因和失活的抑癌基因及其表达产物的特征和变化的检测来实现对肿瘤的基因诊断。用聚合酶链反应（PCR）技术可对某些肿瘤作出有效的早期诊断。Mitsudomi等^[7]提出用荧光纤支镜结合基因诊断是肺癌早期诊断的一个发展方向。

　　Masaynki等^[8]根据不同肿瘤p53基因突变谱不一样的原理进行鉴别诊断。若肺癌术后又发生的肿瘤与原发肿瘤的p53基因构象一致时，则为原发癌的复发，反之则为转移瘤。因而可以确定是否需外科手术治疗。Kazuhito等^[9]用免疫组化染色p53蛋白检测术后NSCLC患者淋巴结，发现淋巴结转移患者中有45%呈阳性，并认为该法在评价术后NSCLC患者淋巴结微小病灶转移时是一个快速、敏感、有效的方法。

　　人体各种正常细胞中都有低含量的p53蛋白，后者容易水解，并且半衰期很短，仅10-20分钟左右，一般难以检测。在生长旺盛的细胞中其含量可增加4倍以上，而在转化细胞或肿瘤细胞中，基含量可增加100倍以上，且不易水解，半衰期较长，在肿瘤细胞中堆积。因而通过对细胞的p53蛋白含量的检测亦可进行肿瘤的基因诊断。但恶性肿瘤的发生常常是在多因素长期作用下，多个基因综合作用的结果，一种肿瘤中会有多种基因变化，而同一种基因又会涉及到不同的肿瘤的发生，评价p53基因异常对肺癌的基因诊断应综合其他众多因素。这亦正是目前肺癌分子生物学和分子遗传学研究的热点。

　　p53基因与肺癌的基因治疗

　　目前，肺癌的基因治疗包括：抑癌基因疗法，免疫基因疗法和自杀基因疗法。在抑癌基因疗法中p53起着举足轻重的作用。作为一种抑癌基因，p53基因有很强的抑制肿瘤细胞生长及使细胞凋亡的能力，目前p53基因已被用于临床上作为基因治疗的主要试验基因之一。将外源野生型p53基因导入p53基因失活的肺癌细胞，能抑制其恶性增殖，逆转其恶性表型^[10]，不仅可对丧失了p53功能的肿瘤细胞进行遗传修饰，而且可利用野生型p53蛋白在正常细胞中的表达保护正常细胞，从而提高抗肿瘤效果^[11]。

　　Zhang^[12-14]以腺病毒作载体介导野生型p53基因，通过基因重组产生出的p53腺病毒 ad 5 CMV-p53能在低剂量（每细胞10单位病毒）感染时，有效抑制有p53基因缺陷的肺癌细胞生长，与对照组相比，生长率降低70%-80%；在高剂量（每细胞100单位病毒）感染时，p53腺病毒能杀灭各种肺癌细胞。这种抑癌杀癌性能可在其他肿癌细胞中重复。在动物模型中，将低剂量p53腺病毒（100/μl5mm直径肿瘤用108±8单位)注射入瘤体内，同时经腹腔注射低剂量化疗药物顺铂，引起了肿瘤内大面积细胞凋亡。该发现具有重要临床价值，被采纳为p53腺病毒的肺癌基因治疗临床试验方案的一个组成部分。体外实验证明p53腺病毒在癌细胞有效杀灭的剂量范围内对正常人支气管上皮细胞生长无明显抑制作用。同时，Zhang等^[12]用Ad5 CMV-p53以30-50 PFU/细胞转染p53等位基因完全缺失的NSCLC细胞系H358，转染率达95%-100%，用Western blot法测得高水平表达的p53蛋白，H358细胞体外生长亦明显受抑（72%-79%），而用Ad5 CMV-p53转染野生型p53基因未完全缺失的肿瘤细胞系时，抑制生长的效率（28%）明显不如前者。此外，Ad5 CMV-p53对肺部转移瘤如LM 2亦有抑制生长的作用^[15]。

　　Fujiwara等^[16]用携带野生型p53基因的逆转录病毒治疗SCLC，能使62%-100%的肿瘤生长受到明显抑制。用该载体在体外转染NSCLC细胞系H226 Br，转染后的肿瘤细胞在体外生长明显受抑制，进一步观察体内转染基因的治疗效果，转染治疗的小鼠肿瘤发生率为0-30%，对照组为62%-80%。Fujiwara等^[16]又用Ad5 CMV-p53治疗人NSCLC细胞系H 226 Br，治疗小鼠只有25%发生了肿瘤，而另两个对照组（用空白病毒和病毒稀释液治疗）中，肿瘤发生率为70%-80%，且Ad5 CMV-p53治疗组中小鼠所发生的肿瘤体积明显小于对照组，合用顺铂后，肿瘤局部亦大片凋亡。

　　1994年上半年，美国重组DNA咨询委员会（RAC）批准了Texas大学Anderson癌症中心Roth等以腺病毒介导的p53基因治疗NSCLC的临床试验，由于重组的病毒载体对人将产生的毒副作用尚不完全清楚，尤其是病毒载体有引起肺炎的潜在危险性，临床试验仅限于病灶局限的病倒，而不能用于癌肿已扩散至胸膜腔的病例。该小组开展的Ⅰ期临床研究在国际肿瘤治疗界影响很大，已有3篇重要论文报告其研究成果^[17-19]：在常规治疗无效证实p53基因突变的NSCLC患者中进行了该疗法，结果在绝大多数患者（10/12）中腺病毒成功介导了p53基因在肿瘤原位的转染，在以后治疗中，绝大多数肿瘤组织继续表达p53基因，并接着在体内出现癌细胞坏死和凋亡。给患者注射Ad p53连续6个月，未见有相关毒性反应。为了监控Ad p53瘤体内注射后体内分布和播散情况，他们建立了细胞病变（CPE）生物测定法和PCR法，可用于血液、尿液和痰液Ad p53基因的检测。另外，Roth构建在β-肌动蛋白启动子控制下的WT- p53基因逆转录病毒载体，用直接注射方法治疗9例常规治疗无效的NSCLC患者，治疗后的活检标本用原位杂交和PCR均检测到WT- p53的表达，在治疗后的标本中凋亡更明显，其中3例患者肿瘤缩小，3例无明显变化。

　　结语

　　p53基因与人类肺癌的关系不断得到深入揭示，但仍存在许多基本原理和重大机制尚未弄清，有待进一步探究其中奥秘，为人类征服癌症提供更丰富的理论依据。

参考文献

1. Minna D,Adv Oncol,1996;12(1):3-7

2. Lu X,Tumor Suppresor Gene p53,In:Chunhai Li,Yajun Guo,Xingsheng Ye eds,Current Advance in Tumor Molecular Biology.96 Beijing International Conference of Tumor Molecular Biology, Beijing ,China,1996,Beijing:Military Medical; Sciences Press,1996:57-609

3. Takahashi T,Carbone D,Takahashi T et al.Cancer Res,1992;52(8):2340-2343

4. Marchetti A,Buttitta F,Merlo G et al.Cancer Res,1993;53(12):2846-2851

5. Quantin X,Pujol JL,Lehmann M et al.Cancer Detect Prev,1997;21(5):418-425

6. Rosenfeld MR,Malats N,Schramm L et al.J Natl Cancer Inst,1997;89(5):381-385

7. Mitsudomi T, Lam S,Shirakusa T et al.Chest,1993;104(2):362-365

8. Masaynki N,Diagn Mol Pathol,1993;2(1):29-35

9. Kazuhito D,Kenji S,Toshihiro D et al.J Thorac Cardiovasc Surg,1997;114(3):339-346

10. Lung ML,Wong MD,Shaanid MT et al Chest,1996;109(3):718-726

11. Devereux TR,Taylor JA,Barrett JC,Chest,1996;109(3 Suppl):14s-19s

12. Zhang WW,Fang X,Mazur W et al.Cancer Gene Ther,19941(1):5-13

13. Zhang WW,Methods,1995;8(3):198-214

14. Zhang WW.Adenoviral vectors and their application in gene therapy,In:Chunhai Li,Yajun Guo,Xingsheng Ye eds.Current Advance in Tumor Molecular Biology,96 Beijing International Conference of Tumor Molecular Biology,Beijing,China,1996,Beijing,Military Medical Sciences Press,1996;30-41

15. Zhang WW,Roth JA,In Vivo,1994;8(15):755-769

16. Fujiwara T,Cai DW,Georges R et al.J Natl Cancer Inst,1994;86(19):1458-1462

17. Roth JA,Nguyen D,Lawrence DD et al.Nat Med,1996;2(9):985-991

18. Roth JA,Human Gene Ther,1996;7(8):1013-1030

19. Roth JA,Human Gene Ther ,1996;7(7):861-874

校对时间：99-12-09　23:20　杜育苗