用荧光原位杂交方法检测肺癌印片标本中性染色体数目的异常

解剖学报 1999年第1期第0卷 论著

作者：董向阳　程书钧　郭素萍　吕永杰　高树庚

单位：董向阳　程书钧　郭素萍　吕永杰　高树庚(中国医学科学院 中国协和医科大学肿瘤研究所病因室，北京　100021)

关键词：肺癌；X染色体；异常；荧光原位杂交(FISH)

　　【摘要】　目的　研究肺癌细胞中性染色体拷贝数的异常。　方法　取新鲜的肺癌手术标本作印片，利用双色荧光原位杂交(dual-color FISH)技术对16例肺癌印片标本(其中男性病例12例，女性病例4例)中X染色体和Y染色体数目进行检测。　结果　发现12/16(75%)的标本中有X染色体数目增多，其中女性患者3例，男性患者9例；在12例男性患者中，有1例发生Y染色体数目增多，有5例(41.7%)发生Y染色体数目减少。总计出现性染色体数目异常的病例为13例，占16例的81.25%。　结论　X染色体数目增多在肺癌中发生的频率很高，其意义值得进一步研究。

SEX CHROMOSOME COPY NUMBER ABERRATIONS IN LUNG

　　CANCER TOUCH PREPARATIONS DETECTED BY FISH

Dong Xiangyang，Cheng Shujun^△，Guo Suping，Lu Yongjie， Gao Shugeng

　　(Department of Etiology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences and

　　Peking Union Medical College, Beijing)

　　【Abstract】Objective To study the sex chromosome copy number alterations in lung cancer.Methods We detected the copy number of chromosome X and chromosome Y in touch preparations made from 16 fresh lung cancer specimens with dual-color fluorescent in situ hybridization(FISH).Results Increased chromosome X copy number was observed in 75%(12/16)specimens, including 9 males and 3 females. In 12 male lung cancer specimens, 1 specimen had gained of chromosome Y, 5 specimens had lost of chromosome Y.Conclusion Gain of chromosome X frequently occurred in lung cancers. The relationship between gain of chromosome X and lung cancer genesis needs further investigations.

　　【Key words】 Lung Cancer; Chromosome X; Aberration; Fluorescent in situ Hybridization(FISH)

　　遗传物质的不稳定性是人恶性肿瘤的特征之一，它既可表现在核苷酸水平上微卫星序列的不稳定，也可表现在染色体水平上的数目和结构异常^［1］。

　　近年来，肺癌的发生率和死亡率逐年上升，成为肺瘤研究的焦点之一。对其细胞遗传学的研究有助于了解肺癌发生发展过程中的遗传改变，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的依据。但是有关肺癌细胞遗传学方面的报道较少，一方面是因为肺癌细胞的分裂指数很低，难以获得足够数目的可供显带分析的中期染色体；另一方面，肺癌细胞的核型极为复杂，难以得到一致的结果^［2，3］。

　　荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)是近年发展起来的一项新技术。它可以方便，快捷地检测出中期分裂相/间期核细胞中染色体数目等异常变化。为实体瘤的遗传学研究提供了新的方法。我们利用双色荧光原位杂交技术检测了16例肺癌印片标本中X染色体和Y染色体数目的异常变化。

　　材料和方法

　　1.肺癌标本

　　16例肺癌手术标本取自本院胸外科，其中男性患者12例，女性患者4例。中位年龄为60岁(35～72岁)。病理诊断结果为：鳞癌9例，腺癌4例，小细胞肺癌2例，肺泡癌1例(表3)。取无杂质，无明显坏死，呈鱼肉状的新鲜癌组织块，用手术刀切出约1 cm²左右的横断面。取干净的载玻片在断面处轻轻接触，制成印片(touch preparation)。室温晾干后，入甲醇：乙酸液(3∶1)室温固定20min，共固定3次，经PBS洗后，室温晾干，于-20℃储存备用。

　　2.正常人外周血淋巴细胞染色体的制备

　　取6例正常人(男性3例，女性3例)外周血各0.5ml，参照文献［4］按照常规细胞遗传学方法制备染色体。即将上述0.5ml血在加有植物血凝素(PHA)(Boehringer Mannheim公司，Germany)的5ml RPMI 1640培养基中培养72h，终止培养前2h，加入秋水仙胺(colcemid)(Fluka公司，Switzerland)至终浓度0.04mg/L，继续培养。离心收集细胞，用0.075mol/L KCl 37℃低渗10min，甲醇：乙酸液(3∶1)固定3次，每次20min，高位湿冷滴片，晾干，-20℃保存备用。

　　3.探针的标记

　　人X、Y染色体特异探针均购自ATCC公司(American Type Culture Collection)。人X染色体特异探针以FluoroRed^TM(Rhodamine-4-dUTP,Amersham公司，UK)标记，杂交后显红色信号，人Y染色体特异探针以FluoroGreen^TM(Fluorescein-11-dUTP,Amersham公司，UK)标记，杂交后显绿色信号。标记采用缺口翻译方法(nick translaton labelling system^TM,GIBCO/BRL)进行，标记后的探针大小在300到800 bp左右。

　　4.荧光原位杂交

　　参照文献［5］并加以改进。肺癌印片或外周血淋巴细胞染色体片经70%乙酸、PBS洗后，70%、90%、100%乙醇脱水，50%甲酰胺-2×SSC中于75℃变性3min，过冷梯度(70%、90%、100%)乙醇，晾干后与经75℃变性过的X、Y染色体探针的混合物杂交(湿盒中37℃过液)。杂交完毕后，经42℃的50%甲酰胺-2×SSC和2×SSC洗，乙醇脱水。DAPI-防褪色液封片。

　　5.结果观察

　　用Nikon荧光显微镜配以三色滤光片(FITC/Texas Red/DAPI)观察。每一标本在镜下选择4～5个区域连续计数300～500个细胞中红色杂交信号(X染色体)和绿色杂交信号(Y染色体)的数目，并计算具有各杂交信号的细胞占总计数细胞的百分比。破碎，边缘不清，重叠及杂交信号无法辨认的细胞不计数在内。杂交信号的判定标准参照文献［6］。杂交结果以Kodak ASA400彩色负片摄片。

　　结果和讨论

　　1.对照研究

　　X、Y探针与正常细胞杂交以确定探针杂交的特异性(图1)。由于技术上和生物学上的原因，即使是正常细胞染色体，其杂交结果也不可能100%都是2倍体，为了消除这一误差并给肺癌印片标本中判定X、Y染色体拷贝数增加或减少提供一个标准，我们用X、Y探针与3例男性及3例女性正常外周血淋巴细胞杂交，结果见表1，2。计算出其99%可信限(上限)作为结果判定的标准，即在女性患者中具有≤1个X染色体杂交信号的细胞占≥6.98%时视为丢失，具有≥3个X染色体杂交信号的细胞占≥3.32%时视为染色体拷贝数增多；男性患者中，对X染色体，具有0个杂交信号的细胞占≥3.64%时视为丢失，具有≥2个杂交信号的细胞占≥5.05%时视为拷贝数增多，对Y染色体，具有0个信号的细胞占≥2.15%时视为丢失，≥2个杂交信号的细胞占≥1.19%时视为拷贝数增多。因为印片中细胞的成分比较复杂，参考相关文献［7］我们将上述标准提高到10%。以增加结果判定的严格性。

表1　X染色体探针在正常细胞中的杂交结果

　　Table 1 The results of the hybridization of chromosome X to normal lymphocytes

表2　Y染色体探针在正常男性细胞中的杂交结果

　　Y to normal lymphocytes

　　2.印片标本杂交结果

　　16例肺癌印片标本的杂交结果见表3及图2。结果显示，12/16(75%)的标本中有X染色体数目增多，其中女性患者3例，男性患者9例，具有异常X染色体数目的细胞比例从14.49%到90.72%。在12例男性患者中，有1例发生Y染色体增多，有5例(41.7%)发生Y染色体数目减少。总计出现性染色体数目异常的病例为13例，占16例标本的81.25%。统计结果未见性染色体数目异常与患者性别、年龄、肺癌分型有相关性。本实验结果显示，性染色体数目异常在肺癌中的发生率很高。

表3　16例肺癌标本的病理资料及印片双色荧光原位杂交结果

　　and the results of the dual-color FISH from the touch preparations

　　3.讨论

　　性染色体异常在许多肿瘤中都有报道。本研究同样发现在肺癌中有X染色体数目增多，Y染色体数目减少。有研究报道，随着年龄的增长，在正常男性中可发生Y染色体丢失现象，并认为这是一个年龄相关(age-associated)事件^［8］。X染色体数目增多在其他肿瘤中，如非何杰金淋巴瘤^［9］、T细胞淋巴瘤^［10］、前列腺癌^［11］、卵巢粒细胞瘤^［7］、结肠癌^［12］也有报道，但在肺癌中未见有类似的报道，而且在其他肿瘤中发生的比例远没有我们在肺癌中所见的高(75%)。性染色体异常在人类肿瘤发生中的作用一直没有引起人们的重视。长期以来认为性染色体只在性别决定中起作用，对性染色体上与人类生长和发育有关的基因研究很少。但近年来的研究发现，CD40配体基因，IL-2受体γ基因^［9］，雄激素受体基因^［12］等许多基因都定位于X染色体上。Zang^［13］的研究指出，男性和女性如果受到同样水平的吸烟刺激，则女性患肺癌的风险比男性大。男、女细胞中虽然都有X染色体，但数目不一样，这一差别是否与此有关，目前还不清楚，但这一现象值得进一步研究。

　　荧光原位杂交(FISH)技术，是用半抗原(生物素、地高辛等)或荧光物质(异硫氰酸盐、诺丹明等)标记探针，经变性后与染色体或细胞杂交，杂交完毕，用相应的抗体检测，最后用荧光显微镜观察结果，以显示所标记探针在染色体上或细胞中的情况的一项技术。利用该技术检测实体瘤中特定染色体数目异常，同传统的细胞遗传学方法相比，具有省时、简便、准确的优点。而用FISH检测印片中特定染色体数目改变，可以直接显示出肿瘤在体内发生的真实异常，避免了由于体外培养发生选择而造成的假象。双色杂交，两个探针之间本身可以作为内对照，避免由于杂交体系不理想而造成的结果误差。当然，FISH有其不足之处，那就是它不能显示染色体结构的变化。用FISH技术可以快速地在间期核中检测出染色体数目的改变。我们发现肺癌中X染色体数目增多，其在肺癌发生、发展中的生物学意义尚不了解，值得进一步探讨。

图版说明

　　图1　示人X染色体(↑)和人Y染色体(▲)两探针在正常男性淋巴细胞中的杂交结果 × 1 500

2　A　病例7肺癌印片杂交结果，示X染色体(↑)拷贝数增多(每1个细胞中有2～3个拷贝X染色体)，同时伴有Y染色体(▲)的缺失 ×1 500

　　B　病例13肺癌印片杂交结果，示每1个细胞有3个拷贝的X染色体(↑)；和1个拷贝的Y染色体(▲) ×1 500

Explanation of figures

　　Fig.1 Representative photomicrograph from a normal male lymphocytes hybridized with human chromosome X specific probe (arrowhead) and human chromosome Y specific probe (arrow) ×1 500

　　Fig.2 A： Representative photomicrograph from a touch preparation of case 7, showing increased copy number of chromosome X (arrowhead, 2-3 copies of chromosome X per cell) accompanied with loss of chromosome Y ×1 500

　　B: Representative photomicrograph from a touch preparation of case 13, showing three copies of chromosome X(arrow-head) and one copy of chromosome Y(arrow) ×1 500

　　△ Department of Etiology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China

　　 参考文献

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　　［2］Teyssier JR. The chromosomal analysis of human solid tumors. Cancer Genet Cytogenet, 1989,37(1):103

　　［3］Testa JR, Siegfried JM,Liu Z, et al. Cytogenetic analysis of 63 non-small cell lung carcinomas: recurrent chromosome alterations amid frequent and wide spread genomic upheaval. Genes Chromosomes anol Cancer, 1994,11(2):178

　　［4］刘权章.人类染色体方法学.北京：人民卫生出版社，1992:232～238

　　［5］Pinkel D,Landegent J,Collins C,et al. Fluorescent in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85(23):9138

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