大肠肿瘤APC基因突变的研究
中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 基础研究
作者：余成仿 王吉甫
单位：510630 广州，暨南大学医学院附属医院外科(余成仿)；中山医科大学附属第一医院胃肠外科(王吉甫)
关键词： 肠，大/病理学 肠肿瘤/遗传学 突变 基因，APC
【摘要】 目的 检测APC基因在国人散发性大肠肿瘤中的突变情况,并探讨APC基因突变与大肠肿瘤生物学行为的关系。方法 采用PCR-SSCP、DNA测序对27例（33份标本）大肠息肉，36例大肠癌和相应正常粘膜及3例家族性腺瘤性息肉瘤(FAP)标本中APC基因“突变密集区”(mutation cluster region MCR)的突变进行了研究。结果 大肠息肉和癌组织中，APC基因MCR突变率分别为30.3%(10/33)和35.9%(14/39)，两者差异无显著性，而正常大肠粘膜、炎性息肉和增生性息肉均无突变。3例FAP发现有2例突变，其中1例从正常粘膜到腺瘤、到癌变组织均有突变，另1例则在＞1.0 cm的腺瘤和肝转移癌组织有突变，测序结果证实该例在1425号密码子存在相同点突变。APC突变与肿瘤的临床病理特征无明显的相关性。结论 APC不仅在FAP中存在突变，而且在散发性大肠肿瘤中亦存在突变；它的突变至少参与了部分大肠癌的发生发展过程，而且是这一过程中较早发生的事件。
mutation of APC gene in sporadic colorectal tumors Yu Chengfang, Wang Jifu. department of Surgery,Affiliated Hospital,Medical College of Jinan University510630
【Abstract】 Objective To investigate mutation of APC gene in sporadic colorectal tumors. MethodsThirty-six samples of colorectal cancer and twenty-eight samples of colorectal polyps resected by operation and endoscopy were collected. As control, normal mucosal tissues in patients with cancer were taken from site 10 cm away from cancer. Three familial adenomatous polyposis (FAP) patients were also included in this study. The mutation cluster region (MCR) within exon 15 of APC gene was amplified by PCR and the PCR products were subject to SSCP analysis. Three mutant DNA fragments screened by PCR-SSCP were sequenced. Results No mutation in MCR of APC gene was found in normal mucosa,inflammatory polyp and hyperplastic polyp. Mutation in MCR of APC gene was found in 7 of 28 cases with sporadic colorectal polyps and in 11 of 36 cases with colorectal carcinomas. The difference in mutation frequency between adenomatous group (including FAP,31.0%) and carcinomatous group(including fAP,35.9%) was not statistically significant (P＞0.05).Mutation of APC gene was detected in two of three FAP patients. The same point mutation of codon 1425 was found in both adenoma tissue and its hepatic metastasis in one FAP patient by DNA sequencing. Conclusion Mutation of APC gene occurs not only in fAP, but also in sporadic colorectal tumors.It takes part in the development of most, if not all,sporadic colorectal carcinomas.
【Subject words】 Intestine, large/pathology Intestinal neoplasms/genetics Mutation Genes, aPC
从癌基因到抑癌基因的研究，人们已认识到细胞癌变及恶性肿瘤的发生和发展是一个涉及多因素、多阶段和多基因变异的过程。有研究表明，与大肠癌有关的癌基因主要有c-myc和K-ras两种，而抑癌基因则有p53、DCC、MCC和APC(adenomatous polyposis coli)等几种。 APC基因即结肠腺瘤性息肉病基因，是90年代初才得到克隆、分离和鉴定的抑癌基因［1］，并证实它的突变在家族性腺瘤性息肉病（FAP）的发生发展过程中起重要作用。目前对散发性大肠肿瘤的研究报道不多，国内尚未见这方面的报道。我们采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP）及全自动测序，对国人散发性大肠肿瘤组织中APC基因第15外显子“突变密集区”(mutation cluster region, MCR)的突变情况进行了研究，并探讨了基因突变与大肠肿瘤生物学行为的关系。
材料与方法
1.标本来源:
(1)收集中山医科大学附属第一医院外科1995年6月～12月间经手术切除的大肠癌标本36例，与距肿瘤10 cm以上的正常大肠粘膜做对照。36例中，男性21例，女性15例。年龄38～83岁，平均61.2岁。直肠癌16例，结肠癌20例。组织学类型：腺癌32例，粘液腺癌3例，未分化癌1例。分化程度：高分化8例，中等分化24例，低分化4例。Duke分期：无A期，B期19例，C期17例。
(2)收集外科内窥镜室经纤维结肠镜切除的大肠息肉标本27例(28个息肉)。男性17例，女性10例。年龄4～76岁，平均41.7岁。28个息肉中，管状腺瘤17例，绒毛状腺瘤4例，腺瘤恶变3例，炎性息肉2例，幼年性息肉和增生息肉各1例。
(3)收集1995年12月～1996年11月间经我科手术治疗的FAP 3例。标本包括：例1(女,34岁)的正常粘膜、腺瘤组织、癌变组织；例2(男,36岁)的正常粘膜、＞1.0 cm腺瘤组织、＜1.0 cm腺瘤组织、癌变组织、肝转移癌组织；例3(男,52岁)的正常粘膜、＞1.0 cm腺瘤组织、＜1.0 cm腺瘤组织、直肠癌变组织、结肠癌变组织。
2.组织DNA制备:按蛋白酶K和酚/氯仿法制备。根据APC序列，我们自行设计并合成了扩增第15外显子MCR的3对引物，引物序列及扩增片段长度为：片段A(299 bp) 5′TACAGAATTATTGTGT- AGAAGA 3′，5′ CGCTCCTGAAGAAAATTCAACA 3′；片段B(295 bp) 5′CAGGGTTCTAGTTTATCTTC 3′，5′TTCTGCTTGGTGGCATGGTT 3′；片段C(300 bp) 5′GGCATTATAAGCCCCAGTGA 3′，5′AAATGGCTCAT- CGAGGCTCA 3′。
3. PCR扩增：按以下方法，使用3对引物分别扩增APC第15外显子MCR的A、 b和C片段。反应总体积：30 μl，其中包括双蒸水19 μl, 10×buffer3μl，2 mol/L×DNTP 3 μl, 上下游引物各1 μl,模板DNA 2 μl, Taq酶1 μl(2U)。以上成分置一0.5 ml离心管中(Taq酶于首次循环后加入)，加入灭菌石蜡油封盖，然后按以下参数扩增：98℃6 分钟后，加Taq DNA聚合酶；94℃ 45秒；58℃ 45秒；72℃ 60秒；30个循环后72℃延伸5分钟。产物经琼脂糖电泳鉴定后置4℃保存备用。
4. PCR-SSCP分析:取扩增产物4 μl，煮沸变性5分钟，加入碱性变性液10μl，再煮沸5分钟，立即置冰浴，上样6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后观察结果。
5.突变DNA序列分析:总反应体积20 μl，包括：标记末端荧光试剂8.0μl(PE公司，含F-ddNTP,Taq酶等), PCR纯化产物2.0 μl(浓度为0.02 μg/μl)，引物3 pmol/L，双蒸水适量。反应条件：96℃ 10秒，50℃ 5秒，60℃ 4分钟，25个循环后，迅速冷却至4℃。上样于全自动测序仪（PRISM310型，PE公司）电泳，进行结果分析。
6.统计学分析:两组间的比较采用χ2检验。
结果
一、PCR-SSCP检测APC基因突变
1.散发性大肠肿瘤组织中APC基因突变：PCR-SSCP是采用中性聚丙烯酰胺电泳分离变性的单链DNA，利用单碱基突变可引起单链构象改变而影响电泳迁徙率的特点，通过与正常对照比较单链带的位置或数量的差异来判断是否有突变发生。结果发现，正常大肠粘膜无突变发生；大肠息肉组织中检测到7例突变，占所检测总数的25.0%(7/28)；大肠癌组织中检测到11例突变，占检测总数的 30. 6%(11/36)，其中1例分别在片段A和C均检测到突变存在，说明该例存在两处突变。
2.家族性腺瘤性息肉病APC基因突变：本组对3例FAP患者的肿瘤组织也进行了体细胞突变的研究。结果例1未发现有突变；例2发现＞1.0 cm的腺瘤组织和肝转移癌组织有突变；例3则正常粘膜、＞1.0 cm腺瘤、＜1.0 cm腺瘤、直肠和结肠癌变组织均发现突变。
二、APC基因突变与肿瘤生物学特征的关系
1.比较大肠癌组织和大肠腺瘤组织APC基因MCR的突变率：本组共检测了39个大肠癌标本(含3个FAP癌标本)，共发现APC基因MCR突变14例，占所检病例的35.9%(14/39)。31个息肉标本(含3个FAP标本)，共发现10例突变，其中腺瘤性息肉29个，突变发生9例，占所测例数的31.0%(9/29)。比较癌与腺瘤的突变发生率，经统计学分
表1 癌、大肠息肉APC基因突变率比较及其与病理特征的关系
| 组织类别 |
突变 |
无突变 |
合计 |
| 腺瘤性息肉 |
9(31.0) |
20(69.0) |
29 |
| 管状腺瘤 |
9 |
13 |
22 |
| 绒毛状腺瘤 |
0 |
4 |
4 |
| 腺瘤恶变 |
0 |
3 |
3 |
| 其他息肉 |
1(12.5) |
3 |
4 |
| 炎性 |
0 |
2 |
2 |
| 增生性 |
0 |
1 |
1 |
| 幼年性 |
1 |
0 |
1 |
| 癌分化 |
14(35.9) |
27(65.8) |
39 |
| 低 |
1 |
3 |
4 |
| 中 |
13 |
14 |
27 |
| 高 |
0 |
8 |
8 |
注：( )内为%析，两者差异无显著性(P＞0.05，表1)。
2.大肠息肉的病理特征与APC基因突变：本组33个息肉标本的病理特征及突变发生的情况见表1。
3.大肠癌的临床病理特征与APC基因突变：本研究发现，大肠癌APC基因突变与患者的年龄、性别及肿瘤部位无关。在病理方面，14例突变均发生在腺癌，除1例发生在低分化癌外，其余均发生在中等分化癌。在Dukes分期方面，本组无A期病例，突变发生在B期9例，占40.9%(9/22)，C期5例，占26.3%(5/19)，两者虽有一定差异，但经统计学分析，两者差异无显著性(P＞0.05)。
三、突变样本DNA序列分析结果:本组抽取经PCR-SSCP筛选的阳性标本3个进行突变 dNA序列分析。其中1例为散发性癌，另1例为FAP患者(例2)的＞1.0 cm腺瘤及肝转移癌，结果见表2。
表2 3例突变DNA序列分析结果
| DNA |
密码子 |
碱基变化 |
突变特性 |
| 散发癌 |
1366 |
GCT→GCG |
同义突变 |
| |
1398 |
AGT→ACT |
丝氨酸→苏氨酸 |
| FAP(腺瘤＞1cm) |
1358 |
GCG→GCT |
同义突变 |
| |
1425 |
GAT→TAT |
天门冬氨酸→酪氨酸 |
| FAP(肝转移癌) |
1425 |
GAT→TAT |
天门冬氨酸→酪氨酸 |
讨论
1986年，Herreara首次报告1例Gardnr综合症患者第5号染色体长臂部分缺失，后经连锁分析，把与FAP发病有关的基因定位于5q21～22，然而，在散发性大肠肿瘤中，该区也频发体细胞性等位基因丢失［2,3］。近年来，有文献报道，APC基因在散发性结肠癌、胃癌、食道癌中亦可发生突变。
APC突变可发生于任何外显子，但以第15外显子(654～2843号密码子)最为常见。Miyoshi等［4］研究结果显示，65%的突变发生在第15外显子的5′端(1286～1514号密码子之间)，因而称之为MCR。本组发现大肠癌组织APC基因MCR突变的总检出率为35.9%，结果与Ogasawara等［5］和Yashima等［6］使用同样方法测得的38%和41%较为接近。大肠腺瘤组织APC基因MCR突变检出率为31%，结果介于文献报道的15.5%～42.4%［7］之间。本组结果还显示，突变主要发生于腺癌，且主要为中等分化程度癌，与Duk分期无显著相关性。根据我们抽取3例经PCR-SSCP筛选后有突变的 dNA样本进行测序的结果，证明该技术判断基因突变是正确的。由于我们仅检测了APC基因很短的一段区域，相信实际突变率还会更高。因此，我们相信APC突变至少在部分散发大肠癌的发生、发展过程中起重要作用，而且是这一过程中较早发生的分子事件。
APC很大，且突变松散，目前还没有发现所谓突变“热点”。本组的序列分析发现，1例散发癌存在两处点突变，即1366号密码子的同义突变和1398号密码子的错义突变（AGT→ACT，编码的氨基酸则由丝氨酸变为苏氨酸）。另1例FAP患者的＞1 cm的腺瘤标本和肝转移癌标本则均在1425号密码子发生相同点突变，即GAT→TAT，编码的氨基酸由天门冬氨酸变为酪氨酸，这一结果支持APC基因突变在FAP发生的起始阶段重要作用的推论［8］。但本组突变DNA测序的例数较少，发现的突变均为点突变，尚不足以说明APC突变的特点，有关APC突变“热点”探讨，还需更多病例的研究。近年研究表明，即使存在几种其他基因的异常，纠正任何一个抑癌基因的缺陷亦可足以抑制肿瘤的发生［9］。Groden等［10］将APC基因分别导入转染3种不同的人结肠癌细胞株，结果导致这些细胞形态学的改变和致瘤性的下降,研究结果令人鼓舞，也为APC基因的研究开辟了广阔的前景。
参考文献
1Kinzler KW,Nilbert MC,Su LK,et al.Identification of fAP locus gene from chmosome 5q21.Science, 1991,253:661-665.
2Solomon E,Voss R,Hall V,et al. Chromosome 5 allele loss in human colorectal carcinomas.Nature, 1987,328:616-619.
3Ashton-Rickardt PG,Dunlop MG,NakamuraY,et al. High frequency of APC loss in sporadic colorectal carcinoma due to breaks cluster in 5q21-22. Oncogene,1989,4:1169-1174.
4Miyoshi Y, Nagase H,Ando H,et al. Somatic mutations of APC gene in colorectal tumors: mutation cluser region in the APC gene.Hum Mol Genet, 1992,1:229-233.
5Ogasawara S,Maesawa C,Tamura G,et al. Lack of mutations of the adenomatous polyposis coli in esophageal and gastric carcinomas. Virchows Arch,1994,426:607-611.
6Yashima K,Nakamori S,Murakami Y,et al.Mutations of the adenomatous polyposis coli gene in the mutation cluster region: comparison of human pancreatic and colorectal cancer.Int J Cancer, 1994,59:43-47.
7De-Benedetti L, Sciallero S,Gismondi V,et al.Association of APC gene mutations and histological characteristic of colorectal adenomas. Cancer Res,1994,54:3553-3556.
8Vogelstein B,Fearon ER,Hamilton SR,et al.Genetic alterations during colorectal tumor development.N Eng J Med, 1988,319:525-532.
9Hargest R,Williamson R.Expression of the APC gene after transfection into a colonic cancer cell line.Gut, 1995,37:826-829.
10Groden J,Joslyn G,Samowitz W,et al.Response of colon cancer cell lines to the introduction of APC,a colon-specific tumor suppressor gene.Cancer Res,1995,55:1531-1539.
(收稿：1997-11-26 修回：1998-03-13)
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