大肠癌细胞周期调控因子表达与微卫星不稳定性的关系

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：阎晓初　柳凤轩　房殿春　罗元辉　鲁荣

单位：阎晓初（重庆第三军医大学附属西南医院病理科，400038)；柳凤轩（重庆第三军医大学附属西南医院病理科，400038)；房殿春（消化内科）；罗元辉（消化内科）；鲁荣（消化内科）

　　关键词： 结直肠肿瘤；细胞周期；微卫星不稳定性

　　【摘要】　目的　探讨大肠癌组织中细胞周期调控因子表达与微卫星不稳定性(MSI)的关系。方法　采用免疫组化、PCR-SSLP法对56例大肠癌分别进行细胞周期调控因子Cyclin d1、P16、P21^WAF1/CIP1、P53、Rb以及PCNA的观测和D18S34、D17S799、D5S409、TCF-2、P53和Rb6个碱基序列位点MSI检测。结果　大肠癌MSI总阳性率44.6%，其中1个位点阳性7例，≥2个位点阳性18例，占32.1%。MSI阳性(MSI^＋)大肠癌Cyclin d1、P53蛋白阳性表达率显著低于MSI阴性(MSI^-)大肠癌，而P21蛋白阳性表达率显著高于MSI^-肿瘤组(P＜0.05)，MSI⁺大肠癌P16阳性率也较MSI^-组略增高，MSI⁺和MSI^-大肠癌Rb蛋白阳性表达率较接近。结论　P21蛋白过度表达对大肠癌MSI的发生可能具有较重要的促进作用，Cyclin d1、P53蛋白表达减少或P16蛋白过度表达与大肠癌MSI的发生可能也有关。

Relationship between the expression of cell cycle regulators and microsatellite instability in colorectal carcinomas

YAN Xiaochu, LIU Fengxuan. FANG dianchun, et al.

　　（Department of Pathology, Southwest Hospital, The Third Military Medical university, Chongqing 400038, China）

　　【Abstract】　Objective　To explore the relationship between the expression of cell cycle regulators and microsatellite instability (MSI) in colorectal carcinomas(CRC).Methods　The expression of cell cycle regulators cyclin D1, P16, P21^WAF1/CIP1, p53, Rb and PCNA were detected by immunohistochemical staining, and MSI at six microsatellite loci (D18S34, D17S799, D5S409, TCF-2, Rb and P53) were examined by PCR-SSLP in 56 cases of colorectal carcinomas.Results　The overall positive rate of MSI of CRC was 44.6% (25/56). MSI was positive at 1 locus in 7 cases, at 2 and more than 2 loci in 18 cases. In CRC with MSI, the positive rate of cyclin D1 and P53 protein was significantly lower, while that of P21 protein was significantly higher than those without MSI (P＜0.05). The positive rate of P16 in CRC with MSI was higher than those without MSI. The expression of Rb proteins was similar in frequency in CRC with or without MSI.Conclusion　Overexpression of P21 may play an important role in MSI genesis in CRC. It may also be related to decreased expression of cyclin D1 and P53 and overexpression of P16.

　　【Subject words】　Colorectal neoplasms;　Cell cycle;　Microsatellite instability

　　大肠癌发生机制较为复杂，涉及一系列分子遗传学的改变。最近国外研究发现遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)和部分散发性大肠癌的发生是由于微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)所致^［1］。而细胞周期调控的分子机制正成为肿瘤发生发展研究的热点^［2］。细胞周期调控因子表达与大肠癌MSI的关系仍不十分清楚。为此，我们采用免疫组化、PCR-SSLP法对56例大肠癌进行细胞周期调控因子表达和MSI检测，探讨细胞周期调控因子在大肠癌MSI发生中的作用和意义。

　　材料与方法

　　1.标本：采用我院1987～1996年间手术切除的56例大肠癌标本，其中新鲜组织22例，石蜡组织34例。每例同时采集残端正常粘膜组织。

　　2.细胞周期调控因子表达检测：采用SP法，分别进行Cyclin d1(1∶40)、P16、P21(1∶40)、Rb (1∶30)、P53和PCNA(1∶100)免疫组化染色，DAB显色。染色结果根据阳性细胞染色强度及其所占视野面积的百分比分别记为：(-)：无阳性细胞；(+)：阳性细胞面积＜25%，呈棕色；(++)：阳性细胞面积≥25%，呈深棕色。PCNA染色采用计数标记指数(labeling index，LI)，即每100个细胞中的PCNA阳性细胞数。

　　3.MSI检测：(1)DNA提取：将冰冻新鲜组织和石蜡组织连续切片10～15张，厚度5μm，参照Zhuang等^［3］报道的微切割技术，收集大肠癌及正常粘膜组织。采用蛋白酶K消化、苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA。(2)寡核苷酸引物：由中国科学院上海细胞学研究所合成。碱基序列为：D18S34(5′-CAG aAA ATT CTC CTG GCT A-3′，5′-CTC ATG TTC CTG GCA AGA AT-3′)；D17S799(5′-ATT gCC AGC CGT CAG TT-3′，5′GAC CAG CAT ATC ATT ATA GAC AA-3′)；D5S409(5′-GAA gGG ATG AAG TGT GGA TT-3′，5′-TCA AGG ACT GTA GGA TGG CA-3′)；TCF-2(5′-GAC CCC ACA GCC TAT TCA GA-3′，5′-TTG ACT GCT GAA CGG CTG CA-3′ )；P53(5′-AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG-3，5′-ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT c-3′ )和Rb(5′-CCT ATC TCC GGC TAA ATA C-3′，5′-AAT TAA CAA GGT GTG GTG g-3′)。(3)PCR扩增与分析：采用美国产2400型PCR仪扩增，反应总体积为20μl，根据引物不同设定循环参数，分别为94℃，40 s～1 min；52℃～56℃，40 s～1 min；72℃，1～2 min。共35～40次循环。取PCR反应产物10 μl加入10%变性聚丙烯酰胺凝胶孔中，电泳条件除Rb为250 v，5 h外，其余均为100 V，5 h。取下凝胶行银染显色。结果判定：每例标本中，肿瘤组织与其相对应的正常组织相比，出现额外的DNA等位片段或等位片段出现缺失即为MSI阳性。

　　4.统计学处理：采用χ²检验和单因素方差分析。

　　结果

　　1.大肠癌组织中细胞周期调控因子表达和MSI的发生频率：5种细胞周期调控因子在56例大肠癌中呈不同程度的表达，其阳性率分别为Cyclin d1 57.1%(32/56)、P16 37.5%(21/56)、P21 64.3%(36/56)、P53 42.9% (24/56)和Rb85.7%(48/56)。其中Cyclin D1、P21、P53以细胞核着色为主（图1），P16主要呈胞浆染色，Rb多呈胞浆和胞核阳性（图2）。

　　图1 中分化管披肝沥胆癌,癌组织Cyclin d1蛋白呈强阳性表达,癌旁粘膜呈阴性 SP染色 ×200 图2粘液腺癌p16蛋白主要呈细胞浆阳性表达 SP染色 ×200

　　56例大肠癌中各微卫星位点MSI检出率(图3～6)分别为D18S3425.0% (14/56)、D17S799 21.4%(12/56)、D5S409 16.1%(9/56)、TCF-2 21.4%(12/56)、Rb17.9%(10/56)和P53 23.2%(13/56)。综合以上6个位点分析，56例大肠癌共检出MSI25例，MSI总发生率为44.6%，其中仅1个微卫星位点发生MSI 7例，≥2个位点发生MSI18例，占32.1%。

　　2.大肠癌MSI与PCNA标记指数比较：本组无论1个位点或≥2个位点MSI阳性(MSI⁺)的大肠癌，其PCNA标记指数均较MSI阴性(MSI^-)大肠癌低（表1），经统计学处理，MSI^-组PCNA lI均值显著高于MSI⁺组（P＜0.01)。而1个位点阳性与≥2个位点阳性组间差异无显著性（P＞0.05)。

M：标准DNA；N：正常组织；T：癌组织图3　大肠癌D18S34位点微卫星不稳定性

M：标准DNA；N：正常组织；T：癌组织图4　大肠癌D5S409微卫星DNA不稳定性

M：标准DNA；N：正常组织；T：癌组织图5　大肠癌P53微卫星DNA不稳定性

M：标准DNA；N：正常组织；T：癌组织图6　大肠癌Rb微卫星DNA不稳定性

表1　大肠癌MSI与PCNA标记指数关系

　　*与MSI^-组比较，P＜0.01　　3.大肠癌MSI与细胞周期调控因子表达的关系（表2）：MSI⁺大肠癌Cyclin d1阳性表达率44.0%，其中≥2个位点MSI⁺者Cyclin D1阳性率38.9%，显著低于MSI^-组Cyclin d1阳性率67.7%(P＜0.05)。MSI⁺和MSI^-大肠癌P16蛋白阳性表达率分别为44.0%和32.2%，两者间差异无显著性(P＞0.05)；但≥2个位点MSI⁺大肠癌P16蛋白多呈强阳性表达。MSI⁺大肠癌P21蛋白阳性表达率(84.0%)显著高于MSI^-大肠癌P21阳性率(48.4%，P＜0.05)；而MSI⁺大肠癌P53阳性率仅为12.0%，MSI^-大肠癌其阳性率高达67.7%，两者间差异有非常显著性(P＜0.01)。Rb蛋白在MSI⁺和MSI^-大肠癌中表达率较接近，分别为88.0%和83.9%，经统计学处理差异无显著性。

表2　大肠癌MSI与细胞周期调控因子表达的关系

　　讨论

　　MSI是由于复制差错引起的DNA简单重复序列的增加或丢失，表现为肿瘤组织与其相对应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。MSI的发生系由于错配修复基因突变，引起基因组DNA复制精确度降低所致^［4］。国外研究表明，MSI主要见于遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)，其阳性率高达70.0%～90.0%^［5］，散发性大肠癌MSI阳性率相对较低，约10.0%～15.0%^［6］，而MSI⁺的大肠癌与MSI^-者相比，前者很少发生K-ras癌基因突变和P53等抑癌基因突变或缺失，表明这部分癌的发生与癌基因和抑癌基因关系不大^［2，7］。MSI作为HNPCC和少数散发性大肠癌一种特殊的改变，提示其可能为大肠癌，尤其是HNPCC发生的又一种新的分子机制。

　　Lothe等^［7］对大肠癌MSI检测与流式细胞计DNA倍体研究显示，MSI⁺大肠癌主要为二倍体，而MSI^-常呈异倍体。Bocker等^［8］对散发性大肠癌MSI与AgNOR检测显示，MSI⁺肿瘤AgNOR计数低，MSI^-肿瘤AgNOR计数高。我们采用PCNA标记方法与MSI对比研究，结果发现MSI^-大肠癌PCNA标记指数显著高于MSI⁺大肠癌，提示MSI⁺大肠癌的细胞增殖活性相对较低，表明其生物学行为较好。

　　关于细胞周期调控因子表达与MSI发生的关系，目前仍不清楚。MSI为基因组不稳定性变化的一种形式，其发生原因主要是由于错配修复基因突变所致。然而，Umar等^［9］研究发现，错配修复基因发挥修复功能还需要其他蛋白参与，并通过实验证实PCNA在MSH2、MLH1错配修复过程中为必需蛋白。同时也发现PCNA参与的错配修复过程先于损伤DNA的再合成。本研究结果显示，MSI⁺大肠癌的Cyclin d1蛋白阳性表达率反而略低于MSI^-组，尤其在≥2个位点MSI⁺肿瘤Cyclin d1蛋白表达明显减少。其原因可能由于Cyclin D1表达减少致使细胞G₁→S期转化缓慢，PCNA合成也降低，PCNA作为参与错配修复的必需蛋白，其减少可引起错配修复功能降低或缺乏，从而增加了MSI发生的可能性。提示Cyclin d1蛋白表达减弱可能与大肠癌MSI发生有关。而MSI⁺肿瘤P16蛋白阳性表达较MSI^-肿瘤高，P16蛋白作为细胞周期转化的负调节因子，具有抑制Cyclin d1- CDK4复合物的作用，可降低PCNA合成，从而达到抑制错配修复的作用。

　　研究表明，P21具有结合和抑制CDK和PCNA引起细胞周期阻止的功能，从而为复制前提供损伤修复时间。但是，Umar^［9］等和Pan等^［10］研究却发现，P21对抑制错配修复的作用比对复制的抑制相对更敏感。本研究发现，MSI⁺大肠癌P21蛋白阳性表达率较MSI^-大肠癌显著增高(P＜0.05)，提示P21蛋白过度表达可抑制大肠癌错配修复基因的修复功能，从而引起MSI的发生。因此我们认为，P21蛋白在大肠癌MSI发生过程中可能具有比较重要的作用。关于P53蛋白表达与大肠癌MSI之间的关系，多数研究发现，P53基因的突变、丢失和其蛋白过度表达与MSI发生呈负相关^［11］。本研究显示，MSI⁺大肠癌P53蛋白阳性表达率仅为12.0%，而MSI^-大肠癌P53阳性表达率高达67.7%，与以上结果相吻合。同时也有研究发现，除P53基因外，K-ras、APC等基因在MSI⁺大肠癌中突变、丢失和其蛋白表达亦显著减少，提出MSI⁺大肠癌的发生与癌基因和抑癌基因无关，存在另一种新的分子机制^［2］。将P53作为细胞周期调控因子看，野生型P53通过介导P21蛋白的产生，而发挥其负向调节细胞周期的作用，只是由于我们采用免疫组化方法，检测到野生型P53蛋白很少，但可以推测野生型P53通过P21蛋白作用，可间接抑制错配修复基因的修复功能，在大肠癌MSI发生中也可能具有一定作用。同时MSI⁺大肠癌细胞增殖活性较低，生物学行为较好也可能与以上细胞周期调控因子表达变化有关。本研究还显示，Rb蛋白的表达，在有无MSI大肠癌间差异无显著性，提示Rb蛋白对大肠癌MSI发生可能作用不大。

　　参考文献：

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收稿日期：1999-05-04