大肠癌组织中端粒酶活性的研究

中华肿瘤杂志 1998年第3期第0卷 基础研究

作者：赵东兵　张伟　金顺钱　刘毅　常绍静　邵永孚

单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所

　　关键词： 结直肠癌　　端粒酶　　癌胚抗原　　肿瘤分期

　　【摘要】　目的　研究大肠癌组织及相应癌旁组织中的端粒酶活性，探讨其作为肠癌肿瘤标记物的可能性。方法　采用TRAP方法研究了40例大肠组织(包括37例大肠癌，3例良性大肠疾病)和20例相应癌旁上皮组织中的端粒酶活性表达。结果　20例癌旁上皮和3例良性疾病组织中，端粒酶活性表达均为阴性；而37例大肠癌组织中，35例显示端粒酶活性表达为阳性，阳性率为94.6%。结论　端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤基因标志，有可能成为大肠癌早期诊断和治疗的理想标志物。

　　Study of telomerase activity in colorectal carcinomas　　Zhao Dongbing, Zhang Wei, Jin Shunqian, et al. Cancer Institute(Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

　　【Abstract】　Objective　To investigate the telomerase activity in human colorectal carcinoma and tumor-adjacent tissue and to investigate the possibility of telomerase as tumor biological marker.Methods　A total of 60 human colorectal tissue specimens, comprising 37 carcinomas, 3 benign lesions and 20 tumor-adjacent tissue specimens were examined for telomerase activity by telomeric repeat amplification protocol(TRAP) assay.Results　No telomerase activity in 20 tumor-adjacent tissues and 3 benign lesions was detected. However, of 37 colorectal carcinoma specimens, 35 were positive for telomerase activity with a 94.6% positive rate.Conclusion　The data suggest that telomerase is a tumor specific gene marker, and may play an important role in early diagnosis and treatment of colorectal carcinomas.

　　【Subject words】　Colorectal neoplasms　　Telomerase　　Carcinoembryonic antigen　　Neoplasm staging

　　无限增殖是癌细胞的重要生物学特性，也是肿瘤难以治愈的原因之一。最新的研究发现，端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关系。一般认为，在细胞癌变早期由于端粒酶的活性增强，致使端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得到稳定，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得永生化^［1］。端粒酶活性在人体多数肿瘤组织中均获检出。大肠癌端粒酶活性的研究国外已有报道^［2］，但国内尚未见到有关的报道。我们采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)^［3］技术对中国人大肠癌组织和相邻正常粘膜组织进行检测，旨在探

　　索端粒酶在中国人大肠癌中的表达情况，并探讨其在肿瘤诊断及治疗方面的应用前景。

材料与方法

　　1.标本来源：37例大肠癌组织、3例大肠良性疾病、20例相应癌旁正常上皮粘膜(距肿瘤10 cm以外)均取自我院1997年3月～6月手术切除标本，标本均于离体后半小时内采集，液氮速冻，后转至-80℃冰箱贮存备用。所有病例均经我院病理证实。

　　2.端粒酶提取：每例标本取100 mg组织，用50 ml液氮在研钵中研成粉末后转至1.5 ml试管中，立即加入400 μl冷洗液(10 mmol/L Hepes-KOH pH7.5,1.5 mmol/L MgCl₂, 10 mmol/L KCl,1mmol/L DTT)，混匀后，0℃放置5分钟，2 000 r/min 4℃离心5分钟，去尽上清；加入预冷的裂解液200 μl(10 mmol/L Tris-HCl pH7.5，1 mmol/L MgCl₂, 1 mmol/L EGTA, 5 mmol/L二巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油)，混匀后，放置0℃裂解30分钟，13 500 r/min 4℃离心30分钟，吸取上清至一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定，放-80℃冰箱冻存。

　　3.端粒酶检测：采用TRAP法检测端粒酶活性^［3］，反应体积25 μl，反应体系含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3), 1 mmol/L MgCl₂, 63 mmol/L KCl, 0.005% Tween-20, 1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L dNTP, 1 μg T4基因32蛋白，0.1 μg/ml BSA, 74 KBq α³²P-dCTP, 2U Taq酶和0.1 μg TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)。加端粒酶提取物6 μg, 混匀后于30℃保温30分钟，90℃ 90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTA- CCCTTACCCTAA-3′)，混匀后在PE480 PCR仪上进行31个循环，循环参数为90℃ 40秒，50℃ 40秒，72℃ 50秒，最后于72℃延长10分钟，加入6 μl电泳加样缓冲液，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X线胶片置-80℃放射自显影，12小时后显示结果。

　　4.统计分析：χ²检验进行统计分析。

结果

　　1.大肠癌及癌旁组织端粒酶活性表达：端粒酶阳性表达者为间隔6 bp的梯形图像(附图)。37例大肠癌组织中检出端粒酶阳性者35例，阳性率为94.6%；20例癌旁粘膜，2例腺瘤与1例炎症疾病均未检出端粒酶活性表达。

　　2.端粒酶活性与大肠癌部位、分化程度、分期及血清CEA水平的关系：端粒酶活性与大肠癌部

1：肺癌细胞系GLC；　2～16：大肠癌组织标本；　17：缓冲液阴性对照

　　附图　大肠癌组织端粒酶活性检测结果

附表　端粒酶在不同临床分组资料中的表达情况

　　位、分化程度、分期及血清CEA水平无关(附表)。

讨论

　　端粒酶于1985年由Greide和Blackurn从四膜虫细胞提取物中首次发现，直到1994年Counter等^［4］发现端粒酶活性仅存于有腹水转移的卵巢癌中，而正常卵巢上皮组织中缺乏，人们在这时才开始真正认识到端粒酶在肿瘤发生发展过程中的重要性。迄今为止，端粒酶已在大多数肿瘤组织中检测到，如神经母细胞瘤(94%)、乳腺癌(93%)、大肠癌(93%)、肝癌(85%)、胃癌(85%)、前列腺癌(84%)、肺癌(80%)、非小细胞癌(76%)等，而在邻近的正常人体组织细胞或良性肿瘤组织中多为阴性，或仅为活性较低的表达^［5］。因此，端粒酶是目前最特异和具有普遍性的肿瘤标记物，其在肿瘤的诊断和治疗方面具有良好的应用前景。

　　端粒酶是一核糖核蛋白体，主要由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶活性。它能以自身的RNA组分为模板，从头合成端粒，以补偿细胞分裂时染色体端粒的缩短，使细胞获得永生化。在高等生物细胞中，精原细胞和少数造血细胞及再生较强的细胞，如未停经的子宫内膜、鳞状上皮细胞基底层等都存在端粒酶活性表达，其他大多数体细胞均未发现可检测到的端粒酶活性，而恶性肿瘤细胞中端粒酶大多被激活。国外已有很多学者开展了大肠癌细胞中端粒酶活性的研究。Yoshida等^［2］检测35例大肠癌组织标本，有32例检出端粒酶活性，占92%；而正常组织端粒酶检测均为阴性，或仅为弱阳性。Monika等^［6］研究了130例结肠组织标本，其中结肠癌50例，邻近正常粘膜组织50例，结肠腺瘤20例，结肠炎10例，90%的结肠癌组织中端粒酶表达阳性，而正常粘膜组织中无端粒酶表达；在腺瘤和炎症疾病中，端粒酶表达分别为60%和40%。我们检测了37例大肠癌标本的端粒酶活性，阳性率为94.6%，与国外报道一致。但2例腺瘤和1例炎症均未发现端粒酶表达，可能与样本数较少有关。由此表明，端粒酶在大肠癌发生发展过程中起着重要作用，有希望成为大肠癌诊断和治疗的理想标志。

　　端粒酶的活化可能与肿瘤的某些生物学行为有关。Hiyama等^［7，8］通过对胃癌和乳腺癌的研究发现，端粒酶阳性者病灶较阴性者大，其淋巴结转移率高，且晚期肿瘤端粒酶阳性率明显高于早期肿瘤。而且通过对预后的观察，发现端粒酶阳性患者的预后较差，提示端粒酶活性的检测可能成为预后判断的指征。我们对大肠癌端粒酶进行检测未发现其与肿瘤分期、分化程度和肿瘤大小有关。因此，有必要进一步通过端粒酶活性定量的方法，探讨端粒酶活性与大肠癌分化、分期及预后的关系。Monika等^［6］通过定量研究发现，端粒酶活性在晚期结肠癌中的表达高于早期癌，并提示端粒酶表达水平的高低可能与肿瘤细胞侵袭、肿瘤进展和转移潜能相关。Andrzej等^［9］通过对乳腺癌的定量研究发现，端粒酶表达水平高低与预后指标无明显联系。因此，有关端粒酶表达与肿瘤分期及预后的关系仍须进一步研究。

　　大肠癌是消化道肿瘤中有希望开展基因诊断技术的肿瘤。由于端粒酶在大肠癌中具有高表达的特点，通过非侵入性的基因诊断方法应用于大肠癌患者的粪便脱落癌细胞的检查，可望成为大肠癌早期诊断和预后监测的较好的指标之一。Yoshida等^［2］已经开始尝试研究大肠癌标本冲洗液中端粒酶的活性表达，结果敏感性为60%，特异性100%，阳性预测值为100%。国外曾有学者尝试用K-ras或CD44等指标检测大肠癌粪便中脱落细胞，但是从肿瘤特异性和普遍性方面来比较，端粒酶优于上述指标。虽然目前尚未有端粒酶在大肠癌粪便中检测结果的报道，但我们相信，通过对大肠癌肠道冲洗液、纤维结肠镜组织活检及粪便中端粒酶活性研究的进一步开展，端粒酶在大肠癌早期诊断和复发监测中必将取得良好的应用价值。

　　既然端粒酶特异性地表达于各种肿瘤细胞，又是肿瘤细胞无限增殖所必需，而且目前认为端粒酶活性增高可能是细胞通向癌变的最后的唯一旁路，因此，针对端粒酶的基因治疗可能有重要意义。Feng等利用反义hTR(human telomerase RNA)可以抑制恶性肿瘤细胞并导致细胞死亡^［10］。相信随着端粒酶蛋白组分的成功分离，对端粒酶的动力学和端粒酶的作用、调控机制认识的进一步加深，端粒酶有可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。

　　本课题部分受中国医学科学院CMB院校长基金资助

参考文献

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　　3Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266: 2011-2015.

　　4Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 2900-2904.

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　　6Monika E, Pamela D, Jose G, et al. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer. Clin Cancer Res, 1997, 3: 1931-1941.

　　7Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995, 55: 3258-3262.

　　8Hiyama E, Gollahan L, Kataoka T, et al. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Inst, 1996,88:116-122.

　　9Andrzej K, Bednarek, Aysegul S, et al. Analysis of telomerase activity levels in breaset cancer: positive detection at the in situ breast carcinoma stage. Clinical Cancer Res, 1997,3:11-16.

　　10蒋建飞，丁健. 端粒酶-肿瘤治疗的新靶点. 国外医学肿瘤学分册，1997，24：29-31.

(收稿：1997-11-14　　修回：1997-12-26)