hMLH1基因Val384Asp的病因学作用及对大肠癌发病年龄的影响

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著

作者：周建农　王亚平　李金田　李忠佑　王建东

单位：周建农（江苏省肿瘤防治研究所　南京市210009）王亚平（江苏省肿瘤防治研究所　南京市210009）；李金田（江苏省肿瘤防治研究所　南京市210009）；李忠佑（江苏省肿瘤防治研究所　南京市210009）；王建东（江苏省肿瘤防治研究所　南京市210009）

关键词：hMLH1基因；错义突变；Val384Asp；病因学；大肠癌

　　摘要　目的:探讨hMLH1基因错义突变Val384Asp在大肠癌发病 中的作用。方法:取101例大肠癌患者、100例正常对照的 血细胞或正常大肠组织样本，提取基因组DNA，PCR－SSCP和 DNA测序技术分析hMLH1基因第12外显子，检测hMLH1基因错义 突变Val384Asp。结果:＜45岁的大肠癌患者中hMLH1基因Val384Asp的 检出率明显高于同龄对照组（P＜0.05），其中35～44岁 年龄组的大肠癌患者与正常对照比较，P＜0.01。结论 :hMLH1基因Val384Asp将影响大肠癌的发病年龄，它的存在可 能是中国人大肠癌发病年龄较欧美人群提前的原因 之一。

The Etiological Role of Va1384Asp in hMLH1 Gene and Its Effect on Pathogenic Age of Colorectal Cancer

Zhou Jiannong Wang Yaping Li Jintian

　　（Jiangsu Cancer Institute, Nanjing ）

　　Abstract Objective: To investigae the etiological role of Va1384Asp in hMLH1 gene in the pathogenesis of colorectal cancer (CRC). Methods: Genomic DNA extracted from normal colon tissue or peripheral blood were subjected to the analysis of Va1384Asp in exon 12 of the hMLH1 gene by PCR－ SSCP followed by DNA sequence of variant bands in 101 colorectal cancer patients and in 100 healthy control individuals. Results: Chi－ square test showed that there was a significant difference in the frequency of Va1384Asp in hNLH1 gene between the patients with CRC at young age (＜45 years old) and the control individuals of same age (P＜ 0.05). The highest frequency of Va1384Asp in hMLH1 gene has been found in the group of 35～ 44 years CRC patients. Very significant difference appeared as compared with healthy individuals (P＜ 0.01). Conclusion: Va1384Asp in hMLH1 gene has a potential effect on pathogenic age of CRC patients. It may be one of the reasons why the CRC onset in Chinese is younger than that in white persons.

　　Key Words hMLH1 gene Missense mutation Va1384Asp Etiology Colorectal cancer

　　遗传性非息肉性大肠癌（Hereditary nonpolyposis colorectal cancer， HNPCC)发病相关基因－错配修复基因的分离是肿瘤遗传 学研究重大进展之一^[1,2]。已经知道，大多数的HNPCC家 族存在错配修复基因的遗传性突变，这是家族中HNPCC发 病的直接原因；在部分散发性和低龄发病的大肠癌 患者也可检出其携带的错配修复基因的突变，但没 有可追踪的大肠癌家族史^[3]。这可能有两个原因：1） 患者获得的是一个新发生的突变（来源于其亲代的 生殖细胞突变）；2)患者携带的是一个低度外显的突 变。我们最近在大肠癌患者筛选错配修复基因hMSH2、 hMLH1突变的工作中，发现中国人中存在hMLH1基因错义突 变Val384Asp^[4]。初步结果表明，Val384Asp是东亚人群hMLH1基因 上的一个多态位点，可能与部分大肠癌的发病有关，且可能影响患者的发病年 龄^[5]。由于初步工作的病例数较少，限制了深入探讨 。本研究旨在扩大样本的基础上，分析比较患者的 发病年龄，确定hMLH1基因Val384Asp在大肠癌发病中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　检测的样本

　　1.1.1大肠癌患者101例大肠癌患者，男60例，女41例。1例 符合HNPCC临床诊断标准，2例由家族性多发性结肠息肉 病恶性转化而来，余为散发性大肠癌患者。发病年 龄23～77岁。其中＜45岁的患者30例（＜35岁13例,35～44岁 17例)；≥45岁的患者71例（45～54岁18例,55～64岁33例，≥65岁 20例）。每例患者取外周静脉血（61例）或手术切除 的远离癌灶的正常组织（40例，病理排除癌细胞浸润 ）。

　　1.1.2正常对照100例对照为正常健康人，其一级亲属中 无明确的癌症患者，男71例，女29例；年龄17～70岁。 其中＜45岁67例，≥45岁33例。每例取外周静脉血。

　　1.1.3样本的民族及地区来源检测的样本均为中国汉族 人。大肠癌患者为近年来我所就诊的患者，主要来 自南京地区和江苏北部地区，安徽东北部地区；正 常对照取自江苏北部地区。

　　1.1.4DNA提取血样本以全血细胞提取DNA；组织样本研磨 后，酚、氯仿法抽提DNA。

　　1.2　PCR－SSCP

　　每例样本均由一对引物特异性地扩增hMLH1基因第12外 显子上游－4位碱基至第12外显子内第1251位碱基（216bp） 。引物序列：

　　5′－ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG－3′（上游）；

　　5′－TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG－3′（下游）。

　　PCR反应体积25μl，其中模板DNA60ng,4×dNTPs终浓度各0.2 mmol/L,MgCl₂1.5mmol/L,Taq酶1～1.5U。循环条件，94°C预变性5分 钟后，94°C40秒，55°C40秒，72°C60秒，35个循环周期， 72°C延长10分钟。取PCR产物6μl加6μl加样缓冲液，95°C变 性5分钟后立即置冰上，行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳。 电泳条件：电泳缓冲液0.5×TBE，电压70V，环境温度4°C， 持续时间18～20小时。电泳结束后凝胶用0.2％的硝酸银 染色。

　　1.3　DNA序列分析

　　SSCP分析出现异常带型的病例，相应的PCR产物直接测序(Amersham，Version 2.0 DNA Sequencing Kit)。

　　1.4　统计学方法

　　各组之间hMLH1基因Val384Asp检出率的比较及Odds Ratio（OR） 值的计算采用Epi Info6.04b统计软件。

　　2　结果

　　2.1　SSCP和DNA序列分析

　　100例正常对照者中6例出现异常电泳带型；101例大肠 癌患者中，13例检出相同的异常带型（图1）。DNA序列 分析表明，这一异常带型的出现是由于hMLH1基因第12外 显子内的第1151位碱基存在遗传性的碱基颠换（T→A， 杂合型），使该碱基所处的第384位密码子发生错义突 变（GTT→GAT,Val384Asp，图2）。不同年龄组的大肠癌患者 和正常对照中，hMLH1基因Val384Asp的检出情况见表1、2。

图1　hMLH1基因第12外显子的SSCP1～4、6～9为野生型

　　基因片段的电泳，5为Val384Asp携带者的样本，显示变异

　　的SSCP带型

图2　hMLH1基因第12外显子序列分析。中国人大肠癌患 者，

　　携带hMLH1基因Val384Asp（杂合型），箭头示存在于1151位

　　碱基的颠换T→A，使384位密码子由GTT→GAT（Val384Asp）

　　2.2　统计分析的结果

　　2.2.1大肠癌患者与正常对照同年龄组间的比较我们 将大肠癌患者和正常对照样本以45岁为界分为两组。 同年龄组间的比较表明(表1），＜45岁的大肠癌患者 中hMLH1基因Val384Asp的检出率显著高于同龄对照（P＜0.05） ；而≥45岁的大肠癌患者与正常对照之间差异不显著（P＞0.05）。

表1　大肠癌患者、正常对照相同年龄组间

　　hMLH1基因Val384Asp检出率的比较

　　2.2.2不同年龄组大肠癌患者与正常对照的比较为进 一步探讨hMLH1基因Val384Asp对大肠癌发病年龄的影响，我 们根据年龄将大肠癌患者分为5组，分别与正常对照 进行比较。结果，35～44岁的大肠癌年龄组与正常对 照之间差异十分显著（P＜0.01，表2）。

表2　大肠癌患者及其各年龄组中hMLH1基因

　　Val384Asp的检出及与正常对照的比较

　　*按年龄分组（岁）**P=0.0096,＜0.01

　　3　讨论

　　hMLH1基因是细胞内错配修复系统的重要组成基因， 它的突变所导致的基因功能的丧失是HNPCC发病的主要 原因之一^[6]。然而基因突变可以产生多种结果，有的 不影响基因功能—无害突变；有的使基因功能完全 失活—病理性突变。其间还存在对基因功能产生不 同程度影响的许多其它突变^[7,8]。在样本量较小的情 况下，后者与表型（发病）之间可能没有明确的数 量关系，对携带这种突变的家族进行分析也看不到 典型的显性或隐性遗传的特征。但突变基因携带者 对环境“适应能力”降低，患癌风险增大。

　　已经知道，由于携带错配修复基因遗传性突变而导 致大肠癌发病的一个显著特征是发病年龄较低，欧 美国家将发病年龄＜50岁作为HNPCC临床诊断标准之一^[9,10]。因此，我们在探讨hMLH1基因Val384Asp的病因学作用 时也充分注意了年龄因素。考虑到中国人大肠癌的 发病年龄普遍较欧美人群低这一特点（平均提前5～ 10年），我们以45岁为界将大肠癌患者分为两组，与 同龄对照进行比较。结果表明，发病年龄＜45岁的大 肠癌患者中hMLH1基因Val384Asp的检出率显著高于正常对照 （P＜0.05）。显然，hMLH1基因Val384Asp与我国部分大肠癌 的发病有关，其作用主要体现在发病年龄较低的大 肠癌患者。

　　为深入探讨hMLH1基因Val384Asp对大肠癌发病年龄的影响， 我们将大肠癌患者分为5组，即青年性大肠癌组（ ＜35岁）；发病年龄较低的大肠癌组（35～44岁）；围 绕中位发病年龄组（45～54岁）；发病年龄较高的大 肠癌组（55～64岁）；高龄大肠癌组（≥65岁），分别 与（合并）对照进行比较（表2）。这是出于两点考 虑：1）个体基因型由遗传而来，在其生命过程中基 因型并不改变。因此作为基因型比较的对照组，可 以忽略年龄因素。2）从表1也可以看出，＜45岁和≥ 45岁的两组对照中，hMLH1基因Val384Asp的检出率分别为4/67和 2/33，两者十分接近。分析结果表明，在35～44岁发病 年龄组hMLH1基因Val384Asp的检出率与对照之间的差异十分 显著（P＜0.01）。这进一步证实，hMLH1基因Val384Asp的存 在将影响到大肠癌的发病年龄。同时提示，在相同 的环境条件下，这一错义突变可能使大肠癌的发病 年龄约提前10年。鉴于中国人中hMLH1基因Val384Asp的等位 基因频率为3％，即约有6％的个体携带这一错义突变 （杂合型）；而欧洲人群可能不存在hMLH1基因的这一 多态位点。我们认为hMLH1基因Val384Asp的存在可能是中国 人大肠癌发病年龄较欧美人群提前的原因之一。我 们今后拟从分子流行病学角度在更大样本的基础上 研究hMLH1基因Val384Asp与中国人大肠癌发病的关系，以弥 补本研究样本量偏小这一不足。

(韩豫生校对)

　　本文课题受江苏省卫生厅重点科研基金资助(H9805)

　　参考文献

　　1，Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, et al. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature, 1994； 368:258

　　2，Papadopoulos N, Nicolaides NC, Wie Y－ F, et al. Mutation of a mutl homolog in hereditary colon cancer. Science, 1994； 263:1625

　　3，Liu B, Nicolaides NC, Markowitz S, et al. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancer with microsatellite instability.

　　4，Wang YP, Friedl W, Lamberti Ch, et al. A novel missense mutation in the DNA mismatch repair gene hMLH1 present among East Asians but not among Europeans. Hum Hered, 1998； 48:87

　　5，王亚平，Friedl W, Propping P, et al. 中国人、日本人和德国人中hMLH1基因Val384Asp的检测及在大肠癌发病中的作用.中华医学遗传学杂志，1998；15:263

　　6，Han HJ, Maruyama M, Baba S, et al. Genomic structure of human mismatch repair gene, hMLH1, and its mutation analysis in patients with hereditary non－ polyposis colorectal cancer (HNPCC). Hum Mol Genet, 1995； 4:237

　　7，Nystrom－ Lahti M, Wu Y, Moisio AL, et al. DNA mismatch repair gene mutations in 55 kindreds with verified or putative hereditary non－ polyposis colorectal cancer. Hum Mol Genet, 1996； 5:763

　　8，Wang YP, Friedl W, Lamberti C, et al. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: causative role of a germline missense mutation in the hMLH1 gene confirmed by the independent occurrence of the same somatic mutation in tumor tissue. Hum Genet, 1997； 100:362

　　9，Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, et al. The International Collaborative Group on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (ICG－ HNPCC). Dis Colon Rectum, 1991； 34:424

　　10，Marra G, Boland CR. Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the gene, and historical perspectives. J Natl Cancer Inst, 1995； 87:1114

(1999－09－14收稿)

　　(2000－01－14修回)