基因检测大肠癌区域淋巴结微转移的研究

中国实用外科杂志 2000年第11期第20卷 论著

作者：刘连杰　叶芳耘　王颢　张乐之　吴丽丽　孟荣贵　沈茜

单位：第二军医大学长海医院普外科上海，200433

　　关键词： 结肠直肠肿瘤；淋巴结；聚合酶链反应；肿瘤转移

　　【摘　要】　目的　探讨大肠癌区域淋巴结微转移的检测和临床意义。方法　采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，扩增角蛋白19(K19)，对12例病人大肠癌肿瘤组织和95个区域淋巴结进行检测。结果　12例病人大肠癌组织均有K19 mRNA表达，良性病人的21个淋巴结均无表达。大肠癌区域淋巴结11个经病理检查有转移，其K19 mRNA表达阳性。84个病理检查未发现转移的淋巴结中有8个K19 mRNA表达阳性。结论　K19 mRNA RT-PCR方法对于大肠癌区域淋巴结微转移灶有辅助诊断价值。

　　中图分类号：R6文献标识码：A

　　文章编号：1005-2208(2000)11-0664-02

Genetic detection of regional lymph node micrometastases of colorectal carcinoma.

Liu Lianjie，Ye Fangyun，Wang Hao，et al.

　　(Department of General Surgery，Changhai Hospital of the Second Military Medical University，Shanghai 200433)

　　【Abstract】　Objective　To discuss the detection of tumor micrometastases in regional lymph node of colorectal carcinoma and its clinical significance.Methods　The expression of keratin 19(K19) mRNA was measured in tumor tissues of 12 cases and 95 regional lymph nodes from colorectal carcinoma patients by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results　K19 mRNA expression was detected in all 12 colorectal carcinoma，but not in 21 benign lymph nodes.11 lymph nodes were found to have metastases by histological staining and K19 RT-PCR.Of the remaining 84 negative lymph nodes，8 lymph nodes were with positive expression of K19 mRNA.Conclusion　The K19 mRNA RT-PCR method can sensitively detect regional lymph nodes micrometastases and is helpful to the diagnosis.

　　【Key words】　Colorectal neoplasm　Lymph nodes　Polymerase chain reaction　Neoplasm metastasis

　　微转移是大肠癌根治术后不能根治的主要原因^［1～3］。本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了大肠癌区域淋巴结角蛋白19(K19)mRNA的表达情况，发现RT-PCR基因检测可辅助诊断淋巴结微转移。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料

　　选择我院1997年5～9月行大肠癌根治术中切除的肿瘤标本12例，良性疾病病人行结肠切除术的结肠标本4例。术前均经纤维结肠镜及病理活检证实大肠腺癌病人12例，男8例，女4例。年龄29～78岁。高分化腺癌4例，中分化腺癌6例，粘液腺癌2例。结肠或肿瘤切除后立即取区域淋巴结及部分肿瘤组织，PBS液清洗后淋巴结取一半液氮储存，另一半编号送常规病理。

　　1.2　cDNA克隆和PCR扩增

　　(1)总RNA抽提：采用组织总RNA抽提试剂盒(华顺生物试剂公司)，淋巴结清洗后取50g组织研磨后加裂解液裂解，氯仿抽提，吸附柱吸附洗脱。(2)引物合成：参照文献，选择K19引物及内参照基因引物。引物由中国科学院上海生化细胞所合成。K19：K1 AGGTFFATTCCGCTCCGGGCA，K2 ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA；内参引物：R1 CACTGTGTTGGCGATCAGGT，R2 TCATCACCATTGGCAATGCT。(3)总RNA溶解于50μL液体中，42℃孵育60分钟反转录合成cDNA。(4)PCR反应：反应体系为30μL，包括cDNA 5μL，K1、K2、R1、R2各1μL，dNPT浓度为500μM/L，DNA聚合酶1U。按95℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 55秒扩增32循环，最后72℃延伸3分钟。(5)2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。K19 mRNA扩增片断为460bp，内参引物为154bp。

　　2　结果

　　2.1　K19 mRNA表达情况

　　在4例正常结肠组织、12例肠癌组织K19 mRNA表达均为阳性。4例良性大肠疾病包括盲肠憩室出血1例、盲肠炎性肿块1例、粘连性肠梗阻1例和慢运输型便秘1例，共取21枚淋巴结，K19 mRNA表达均为阴性，内参基因表达阳性，排除RNA降解。

　　2.2　组织学检查和K19 mRNA RT-PCR检测区域淋巴结微转移的比较

　　12例大肠癌病人共取材95个淋巴结。其中11个淋巴结组织学检查存在转移，K19 mRNA表达均为阳性。84个淋巴结组织学检查为阴性，RT-PCR检测其中8个淋巴结K19 mRNA表达阳性，表明存在癌的微转移灶，但未能通过常规组织学方法检出。组织学检查淋巴结转移率为11.6%，K19 mRNA RT-PCR检测微转移率达20%。

　　2.3　大肠癌Dukes分期的升级

　　12例大肠癌病人如按常规组织学检查进行Dukes分期，Dukes B期病人8例，C期病人4例。2例大肠癌病人，传统检查区域淋巴结阴性，而K19 mRNA RT-PCR检测发现有3枚淋巴结存在微转移，故Dukes分期由B期升为C期。2例Dukes C期病人，经K19 mRNA RT-PCR检测发现更多区域淋巴结转移。

　　3　讨论

　　微转移是大肠癌根治术后复发和转移的主要原因^［3］，CT、MRI、单抗放射显影技术等都很难发现微转移^［1，2］。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种方法，但连续切片工作量大，每例病人常需制作千余张切片，难以常规进行。免疫组化、免疫荧光和放射免疫检测具有重要应用价值，但单抗的质量、交叉反应、自身抗体等因素影响其敏感性、特异性。

　　有研究表明，Dukes B期大肠癌病人相当一部分实属Dukes C期^［3］。还有报告淋巴结检测数量少于6个的Dukes B期大肠癌预后较差。故应该尽可能检测所有切除的淋巴结并对每个淋巴结进行更准确的判断。我们对已经常规方法摘除淋巴结的大肠癌病理标本再通过淋巴结清洗液处理发现了更多的淋巴结，其中一部分实属Dukes C期。

　　RT-PCR是目前较为敏感的检测方法，可准确检测到1mL血液或1g组织中的1个肿瘤细胞^［1］。如应用PCR检测CD44、K-ras、P53等的突变，可检测到Dukes B期大肠癌区域淋巴结10%～28%已有微转移^［3］，应用CEA mRNA的RT-PCR方法检测大肠癌外周血、骨髓的微转移都取得了可喜结果，但大肠癌基因突变率仅为50%左右，各类大肠癌细胞中只有65% CEA表达阳性，健康人群却有23%表达阳性。联合检测可提高敏感性和特异性，但繁琐、昂贵。我们对CEA mRNA也进行了检测，发现假阳性较多，对于一些类型大肠肿瘤CEA可为阴性。

　　K19是最常见的角蛋白之一，它主要分布在单层上皮细胞，如肠上皮、胰管、子宫内膜等，具有高度的组织特异性^［4］，其mRNA在正常淋巴结、外周血、骨髓中不表达或低表达，而在乳腺癌、子宫内膜癌、大肠癌等发生、发展、转移过程中自始至终为高表达，因此可作为乳腺癌、大肠癌等的标志物进行微转移灶的检测^［1，2］。采用RT-PCR方法检测正常淋巴组织均为阴性，而加入少量肿瘤细胞即为阳性，对K19 mRNA阳性的淋巴结进行联合检测常发现存在其它肿瘤标志物，如配合免疫组化可发现单个肿瘤细胞。故K19 mRNA阳性的淋巴结可认为微转移，假阳性率非常低。对于其它组织如血循环、骨髓尚有争议，因为后两者细胞类型复杂。有些学者对基因诊断微转移的淋巴结的另一半再次连续切片，其中可发现转移灶。我们发现，良性疾病的淋巴结均为K19 mRNA阴性，而病理证实转移的淋巴结K19 mRNA均为阳性，证明了其特异性、敏感性。应用K19 mRNA RT-PCR方法明显提高了区域淋巴结的微转移诊断率，利用微转移检测可使部分肠癌病人分期升级，有助于转移灶的早期诊断、进行辅助治疗和预后的判断。

　　微转移的意义尚有争议。有研究表明，伴淋巴结微转移的大肠癌病人71例中约38%在5年内有远处转移或复发，而37例无微转移的病人无一例复发^［2］，认为微转移是一个独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。Bustin等^［5］对多种方法进行比较，认为K19作为大肠癌检测标志物优于CD44、K-ras、P53、CEA、CK8、CK20等。但也有报道K19 mRNA低表达见于头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、泌尿系肿瘤等多种肿瘤，且正常血循环可有表达或有假性基因存在^［4］。

　　由于PCR方法本身的建立需要反复实践才能摸索出最佳条件，目前K19 mRNA的RT-PCR检测主要用于研究和探索。相信随着微转移诊断方法的不断完善和简化，其将成为临床诊断的有力手段，并将揭示微转移的机制，明确微转移与复发、临床转移、生存期及各种治疗方法的关系，从而带来诊断、治疗的根本变化。

参考文献

　　1，Raj GV，Moreno JG，Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumors.Cancer，1998；82(8)：1419

　　2，Hayashi N，Ito I，Yanagisawa A，et al.Genetic diagnosis of lymph-node metastases in colorectal cancer.Lancet，1995；345(7)：1257

　　3，Dorudi S，Kinrade E，Marshall NC，et al.Genetic detection of lymph node micrometastases in patients with colorectal cancer.Br J Surg，1998；85(1)：98

　　4，Denis MG，Lipart C，Leborgne J，et al.Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood of colorectal cancer patients.Int J Cancer，1997；74(2)：540

　　5，Bustin SA，Gyselman VG，Williams NS，et al.Detection of cytokeratins 19/20 and guanylyl cyclase C in peripheral blood of colorectal cancer patients.Brit J Cancer，1999；79(5)：1813

(1999-11-28收稿　2000-06-15修回)

　　【文后评论】　鉴于区域淋巴结有无转移对决定病人的预后和术后治疗方案具有重要意义，因而检测淋巴结有无转移是手术后的一项重要工作。目前这项检测主要依靠组织病理学检查，而受检淋巴结数和每个淋巴结的切片数无疑会影响检测的结果。由于日常繁多的病理检查，出现漏检和假阴性结果在所难免。本文报道采用RT-PCR检测淋巴结K19 mRNA，结果发现在84个病理检查阴性的淋巴结中8个K19 mRNA表达阳性，提示有微转移存在，从而使8例Duckes B期病人中2例上升为C期。这从一个侧面反映了这一检测的敏感性。可惜本文未设对照组，如能与淋巴结连续切片相对照，那就更能说明检测K19 mRNA的价值。另一方面也不得不看到从研究转入常规检查毕竟还有一段距离。因为RT-PCR法虽在研究中已成为较常用的方法，但如术后每个病例都这样去做，在手续、费用等方面恐怕还不现实。事实上从研究至临床需要有一个过程，通过筛查、比较来确定，这丝毫不否定进行研究，只是希望研究时设计更严密，病例数也能更多，方法尽可能简化，使研究更贴近临床，研究结果能为临床所用。

上海第二医科大学瑞金医院外科教授　郁宝铭