RT-PCR方法诊断大肠癌淋巴结微转移

中国实用外科杂志 2000年第1期第20卷 论著

作者：万远廉　潘义生　刘玉村　郭源　魏群

单位：北京医科大学第一医院外科　100034

　　关键词： 大肠肿瘤/酶学；金属蛋白酶；淋巴结；肿瘤转移；聚合酶链式反应

　　【摘　要】　目的　探讨提高大肠癌淋巴结微转移诊断率的敏感方法。方法　用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测基质金属蛋白酶-7(MMP-7)mRNA在38例大肠癌和25个淋巴结中的表达，对部分淋巴结再次行组织学检查。结果　97.4%(37/38)的大肠癌中MMP-7 mRNA表达阳性，而正常粘膜几乎不表达。传统组织学检查发现癌转移的13个淋巴结MMP-7mRNA表达均为阳性；未见转移的12个淋巴结MMP-7 mRNA表达6个阴性、6个阳性，再次行组织学检查于6个MMP-7阳性者中发现3个有微转移。结论　RT-PCR方法检测淋巴结中MMP-7 mRNA的表达是诊断大肠癌淋巴结微转移的敏感方法，可以作为传统组织学检查的补充。

Detection of lymph node micrometastases in colorectal carcinoma by reverse transcriptase-polymerase chain reaction

Wan Yuanlian,Pan Yisheng,Liu Yucun

　　(Deparment of Surgery,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)

　　【Abstract】 Objective To investigate a sensitive method for detecting lymph node micrometastases in colorectal carcinoma.Methods RT-PCR technique was used to examine the expression of MMP-7 mRNA in colorectal carcinomas and lymph nodes.Histological re-examination was performed on some of the lymph nodes.Results MMP-7 mRNA was observed in 97.4%(37/38) colorectal carcinomas,while it was undetectable in almost all the normal mucosas.All 13 histologically-positive lymph nodes were positive for MMP-7,while of 12 histologically-negative lymph nodes,6 were positive and the other 6 were negative.When histological re-examination was performed on histologically-negative lymph nodes,micrometastases were detected in 3“MMP-7 positive”lymph nodes.Conclusion RT-PCR assay for MMP-7 mRNA is a sensitive method for detecting lymph node micrometastases in patients with colorectal carcinoma,and may complement conventional histopathology.

　　【Key words】 Colorectal neoplasms/Enzymology Metalloproteinases Lymph nodes Neoplasm metastasis Polymerase chain reaction

　　淋巴结转移是导致大肠癌病人不良预后的重要因素，然而传统组织学检查对淋巴结转移，尤其是微转移的诊断有很大局限性。基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)是一种与大肠癌的浸润和转移密切相关的蛋白水解酶，其表达具有上皮来源的肿瘤细胞特异性。本实验用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测大肠癌及淋巴结中MMP-7 mRNA的表达，以寻求诊断淋巴结微转移的敏感方法。

　　1　材料与方法

　　临床资料：38例大肠癌和相应正常粘膜随机取自我院1997年11月至1999年1月的住院手术病人。同期取到来源于12例病人的25个结肠系膜淋巴结，均取一半用于本实验，另一半进行传统组织学检查；组织学检查报告13个淋巴结有癌转移，12个淋巴结未见转移。

　　RT-PCR方法检测组织中MMR-7 mRNA的表达：MMP-7引物序列为上游5’-AGATGTGGAGTGCCAGATGT-3’，下游5’-TAGACTGCTACCATCCGTCC-3’，扩增片段365bp^［1］；相同条件扩增β-actin作为内参照，引物序列为上游5’-CTGTCTGGCGGCACCACCAT-3'，下游5’-GCAACTAAGTCATAGTCCGC-3’，扩增片段254bp^［1］。

　　异硫氰酸胍一步法提取组织总RNA，取总RNA5μg于20μL逆转录体系中合成cDNA。取cDNA模板2μL在25μL体系中进行PCR反应，94℃预变性5分钟，循环参数为94℃45秒、57℃75秒、72℃90秒，28个循环，72℃后延伸10分钟。PCR产物经自动测序证实是MMP-7的特异序列。取PCR产物10μL经15g/L琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外光下照相。

　　对传统组织学检查未见转移的12个淋巴结再次行多张切片，仔细检查。

　　2　结果

　　(1)　97.4%(37/38)的大肠癌中MMP-7 mRNA表达阳性；相应正常粘膜36例阴性，只有2例弱阳性。作为内参照的β-actin在癌组织和正常粘膜中表达稳定。

　　(2)　传统组织学检查发现癌转移的13个淋巴结MMP-7 mRNA表达均为阳性；而传统组织学检查未见转移的12个淋巴结MMP-7 mRNA表达6个阴性、6个阳性，再次切片检查于MMP-7阴性的6个淋巴结中发现3个有微转移，而MMP-7阴性者均未见转移。

　　3　讨论

　　淋巴结转移是影响大肠癌预后的重要因素之一；然而在传统的组织学检查中，对每个淋巴结通常只进行1～2张切片，所以对淋巴结转移，尤其是淋巴结微转移的诊断有很大局限性。随着分子生物学和免疫组织化学技术的发展，可以对一些肿瘤细胞特异性抗原或基因在淋巴结中的表达进行检测以确定有无癌转移，并且报告这些方法的敏感性高于传统组织学检查^［2，3］。

　　基质金属蛋白酶(MMPs)是一族Zn²⁺依赖性的蛋白水解酶，能够降解多种基底膜和细胞外基质成分，在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。MMP-7是MMPs家族的重要成员，分子量28KDa，是MMPs中唯一的由上皮性肿瘤细胞特异性表达的酶；而MMPs的其它成员则主要由肿瘤的间质细胞表达。本实验显示97.4%(37/38)的大肠癌中MMP-7 mRNA表达阳性，而正常粘膜中几乎不表达，与文献报告相符^［1，4］；McDonnell研究发现MMP-7由大肠癌细胞及个别的异型性上皮细胞表达，而肿瘤间质和淋巴细胞中均不表达^［4］；说明MMP-7在大肠癌中的表达具有很强的癌细胞特异性。

　　因此，淋巴结中MMP-7 mRNA的阳性表达可以作为诊断大肠癌淋巴结转移的依据。本实验表明传统组织学检查发现癌转移的13个淋巴结MMP-7 mRNA表达均为阳性；而传统组织学检查未见转移的12个淋巴结中也有6个MMP-7 mRNA表达阳性，说明这6个淋巴结中很可能存在组织学检查未发现的微转移灶。为证实此结论，我们对传统组织学检查未见转移的12个淋巴结再次行切片检查，在MMP-7阳性者中发现3个有大肠癌微转移，而MMP-7阴性者均未发现转移。Ichikawa的研究结果也与本实验相符^［5］。这说明用RT-PCR方法检测淋巴结中MMP-7 mRNA的表达是诊断大肠癌淋巴结转移，尤其是微转移的敏感方法。

　　RT-PCR技术具有很高的特异性和敏感性，很少量的癌细胞即可被检出；可以同时对大量标本进行检测并且整个程序只需1～2天；其优点还在于提取整块淋巴结组织的RNA进行检测，克服了传统组织学检查和免疫组织化学方法只能切取数个淋巴结切面的缺点。在大肠癌中，由于MMP-7 mRNA表达的阳性率超过90%，用RT-PCR方法在分子水平诊断淋巴结微转移对多数大肠癌病人均适用，可以作为传统组织学检查的补充。

　　关于淋巴结微转移的发展与转归，Hayashi报告73%(27/37)的有淋巴结微转移的大肠癌病人于术后5年内肿瘤复发，而无淋巴结微转移的34例病人同期均未见复发^［6］；Greenson报告有淋巴结微转移的病人的预后明显差于无淋巴结微转移者^［2］。这些研究表明大肠癌的淋巴结微转移最终会发展成为临床转移并导致病人的不良预后；淋巴结微转移的诊断可以为大肠癌的综合治疗和预后评估等方面提供重要信息；对有淋巴结微转移的大肠癌病人有必要进行积极的术后化疗等辅助治疗，以减少肿瘤复发和转移的机会。

参考文献

　　1，Yoshimoto M,Itoh F,Yamamoto H,et al.Expression of MMP-7(PUMP-1)in human colorectal cancers.In J Cancer,1993;54(4):614

　　2，Greenson JK,Isenhart CE,Rice R,et al.Identification of occult micrometastases in pericolic lymph nodes of Dukes'B colorectal cancer patients using monoclonal antibodies against cytokeratiin and CC49.Cancer,1994;73(3):563

　　3，Mori M,Mimori K,Inove H,et al.Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Cancer Res,1995;55(15):3417

　　4，McDonnell S,Navre M,Coffey RJ,et al.Wxpression and localizaation of the matrix metalloproteinase pump-1(MMP-7)in human gastric and colon carcinoma.Mol Carcinog,1991;4(6):527

　　5，Ichikaws Y,Ishikawa T,Momiyama N,et al.Setection of regional lymph node metastasis in colon cancer by using R-PCR for matrix metalloproteinase 7,matrilysin.Clin Exp Metastasis,1998;16(1):3

　　6，Hayashi N,Ito I,Yanagisawa A,et al.Genetic diagnosis of lymph-node metastasis in colorectal cancer.Lancet,1995;345(8960):1257

(1999-07-02收稿　1999-08-26修回)