TNFα诱导人大肠癌Lovo细胞凋亡的时间效应

世界华人消化杂志 1998年第1期第6卷 研究原著

作者：梁卫江¹ 黄卓垣² 丁彦青²

单位：1空军广州医院小儿内科 广东省广州市 510602;2第一军医大学病理学教研室 广东省广州市 510515

　　 time effect of TNFα on apoptosis of Lovo cells of human colorectal carcinoma

　　liang WJ, Huang ZY, Ding YQ

　　Time effect of TNFα on apoptosis of Lovo cells of human

　　colorectal carcinoma

　　lIANG Wei-Jiang, HUANG Zhuo-Yuan and DING Yan-Qing

　　department of Pathology, the First Military Medical University, Guangzhou

　　510515, Guangdong Province, China

　　Subject headings tumor necrosis factor/pharmacology; apoptosis/drug effects;

　　colonic neoplasms/pathology; rectal neoplasms/pathology;

　　Abstract

　　AIM To explore the possibility and regulation of apoptosis Lovo cells of human

　　colorectal carcinoma induced by tumor necrosis factor-α(TNFα).

　　mETHODS After Lovo cells were cultured in vitro and treated with TNFα 1×10⁸U/L

　　for 0 to 48 hours, the morphological changes of apoptosis were observed by HE and

　　hoechst 33258 dyeing under optical microscope and the percentage of apoptosis was

　　counted, and DNA fragments were detected with DNA electrophoresis.

　　rESULTS While Lovo cells were treated by TNFα 1×10⁸U/L for 0, 12,24,36 and

　　48 hours, the morphological changes of apoptosis appeared gradually, and the percentage

　　of apoptosis were 2.04%, 6.95%, 23.89%, 60.47% and 92.66% (P＜0.01) respectively.

　　when Lovo cells were treated for 48 hours, the ladder of DNA electrophoresis was observed.

　　CONCLUSION TNFα can induce apoptosis of Lovo cells of human colorectal

　　carcinoma with time effect.

　　主题词 肿瘤坏死因子/药理学；脱噬作用/药物作用；结肠肿瘤/病理学；直肠肿瘤/病理学

　　中国图书资料分类号 R 735.34

　　摘 要

　　目的 探索肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导人大肠癌细胞凋亡的可能性及其发生规律.

　　方法 用细胞体外培养方法，以TNFα 1×10⁸U/L作用人大肠癌Lovo细胞0 h～48 h，经HE染色和Hoechst 33258荧光染色，光镜观察细胞的形态改变并计算凋亡百分率；

　　dNA抽提、琼脂糖凝胶电泳，检测DNA断裂情况.

　　结果 随作用时间由0，12，24，36延长到48 h，Lovo细胞渐出现明显的凋亡形态学改变，凋亡百分率分别为2.04%，6.59%，23.89%，60.47%，92.66%(P＜0.01)；作用48 h，DNA电泳出现梯形条带.

　　结论 TNFα能够诱导人大肠癌Lovo细胞凋亡，并存在时间效应.

　　0 引言

　　细胞凋亡与肿瘤的发生、发展与转归有着密切的关系.如何诱导肿瘤细胞凋亡，寻找肿瘤治疗新途径，已成为凋亡研究的热点之一.细胞凋亡的发生可因生长因子的去除及细胞毒因子的存在而触发.国内外近年的研究显示，肿瘤坏死因子(tumor

　　necrosis factor, TNF)是一种细胞毒因子，能够引起某些肿瘤细胞凋亡^［1］，但未见诱导人大肠癌细胞凋亡的研究报道.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 无支原体新生小牛血清，RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，TNFα(北京邦定公司基因工程合成)，Lovo细胞株(美国)，Hoechst 33258(美国Sigma公司)，苏木素、伊红(HE)，蛋白酶K，RNA酶，pBR322 DNA/HaeⅢ marke(华美公司)，细胞裂解液^［2］：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100 mmol/L的EDTA，10 g/L SDS，消化液：2 g/L胰蛋白酶、0.2 g/L的EDTA，10 g/L琼脂糖凝胶.

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞系培养 人大肠癌Lovo细胞在体外用含0.1 L/L小牛血清的RPMI-1640完全培养液、置50 ml/L cO₂培养箱中培养，温度37℃. 每2 d～3 d换培养液1次.

　　细胞经消化液消化后传代.

　　1.2.2 细胞处理 细胞传代至35 ml培养瓶中，细胞数为5×10⁸/L. 共设3组，第1组用作HE染色，第2组用作荧光染色，第3组用作DNA抽取、电泳.在对数生长期，换培养液并处理细胞. 1，2组各有5个培养瓶，Ⅰ号瓶均作对照，不加TNFα；Ⅱ～Ⅴ号均加TNFα 1×10⁸U/L，继续置50 ml/L CO₂培养箱中培养，分别作用12，24，36，48 h.

　　第3组有4个培养瓶，Ⅰ号作对照，不加TNFα；Ⅱ，Ⅲ号均加TNFα 1×10⁸U/L，分别作用36，48 h；Ⅳ号不加TNFα，而于48 h内反复置-20℃ 10min 共6次，使细胞出现病理性坏死，在DNA电泳时作坏死细胞的观察. 细胞收集于10 ml离心管中备用.

　　1.2.3 HE染色光镜观察 滴加第1组5个样品的细胞悬液于载玻片上，成单细胞层.

　　100 ml/L福尔马林固定10min，常规HE染色，光学显微镜观察细胞形态.

　　1.2.4 Hoechst 33258 染色及荧光显微镜观察 根据《细胞生物学实验方法与技术》^［3］进行染色. 滴加第2组5个样品的细胞悬液于载玻片上，成单细胞层.3∶1甲醇：冰醋酸液4℃固定5min；5 mg/L的Hoechst 33258闭光染色5min；荧光显微镜下观察. 计算每样品5个高倍(×400)视野平均细胞总数和凋亡细胞数，算出凋亡百分率，统计学分析用χ²检验.

　　1.2.5 DNA抽提及电泳 根据《分子生物学常用实验方法》^［2］进行DNA抽提和电泳.

　　第3组细胞加细胞裂解液0.5 ml，蛋白酶K 50 μg，54℃过夜；加等体积1∶1的酚：氯仿和异戊醇(后2者为24∶1)；5000r/min离心5min，上清液0.5?!ml加1/10体积3 mol/L的醋酸钠和预冷2.5倍无水乙醇，-20℃ 3 h；15 000r/min离心15min，弃上清，700 ml/L乙醇1 ml洗1次，加TE液稀释的100 mg/L的RNA酶30 μl，37℃水浴振荡20min. 另取

　　dNA marker 3 μl加蒸馏水7 μl. 取各样品10 μl，加于含溴化乙锭的10 g/L琼脂糖凝胶上，恒压恒流电泳1.5 h.

　　2 结果

　　2.1 HE染色光学显微镜观察 可见Ⅰ号对照培养的细胞呈大小较一致的园形，核大浆小，浆桃红色，核紫红色均质状. 而Ⅱ～Ⅴ号TNFα 1×10⁸U/L作用不同时间的样品，可见逐渐增多的凋亡细胞：胞体缩小，胞膜完整，核不规则，固缩、浓染，或呈颗粒状、小块状，以Ⅴ号作用48 h的为明显.

　　2.2 Hoechst 33258染色荧光显微镜观察 因为Hoechst 33258只与DNA结合，故RNA及胞浆均不着色，更便于观察以核改变为主的凋亡细胞.在紫外光激发下，细胞核呈黄绿色.Ⅰ号对照培养的细胞大多数呈大小较一致的园形，染色均匀，为正常细胞核形态(图1). 而Ⅱ～Ⅴ号TNFα 1×10⁸U/L作用不同时间的细胞可见逐渐增多的凋亡细胞核改变；核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈颗粒、块状浓染，以Ⅴ号作用48 h的为明显，绝大多数已呈凋亡 细胞核的形态学改变(图2). 各样品5个高倍视野(×400)

　　平均细胞数和凋亡细胞数如表1，算出凋亡百分率. 经统计学χ²检验，得P＜0.01，有显著性差异，说明随作用时间延长，凋亡百分率显著性提高(图3).

　　图1 常规培养的Lovo细胞核形态(Hoechst 33258荧光染色×400)

图2 TNFα 1×10⁸U/L作用48 h的Lovo凋亡细胞核形态(Hoechst 33258荧光染色×400)

图3 TNFα诱导Lovo细胞凋亡的时间效应图4 Lovo细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳(TNFα的时间效应)

　　a. marker; b. TNFα 1×10⁸U/L作用48 h

　　c. TNFα 1×10⁸U/L作用36 h； d. Control

　　e. 反复置-20℃10min×6次.

　　表1 TNFα诱导Lovo细胞凋亡的时间效应^*

　　^*TNFα终浓度1×10⁸U/L；χ²值=376.3568，P＜0.01.

　　2.3 DNA电泳 在紫外光激发下，DNA与溴化乙锭结合而呈桔黄色.Ⅰ号对照培养细胞的DNA呈基因组型，位于加样孔前约0.3 cm处；Ⅱ号TNFα 1×10⁸U/L作用36 h未见明显的梯形条带，Ⅲ号TNFα 1×10⁸U/L作用48 h出现典型的梯形(ladder)条带；Ⅳ号反复置-20℃的细胞呈膜状的坏死性条带(图4).

　　3 讨论

　　细胞凋亡是具有一定形态学特征的细胞死亡形式.首先，细胞间连接疏松，失去接触，细胞皱缩，细胞器除内质网扩张外，其余基本完好；核染色质凝集于核膜内侧，核孔之间.以后，核裂解，进一步出现膜的气泡化及细胞裂解，形成胞膜包裹的凋亡小体(含残核和/或细胞器).最后，邻近未凋亡的肿瘤细胞吞噬调亡小体并将其降解、消化^［4］.细胞凋亡的生化特征，是各种致凋亡因素作用于细胞后，核酸内切酶被激活，使DNA在核小体连接处断裂，形成大小不一的、呈核小体180～200bp倍数的DNA小片段，在DNA电泳时，呈现梯形(ladder)条带.

　　这种ladder带的出现，需有一定量的DNA小片段，多认为发生在核形态学改变的晚期. 一些实验报道，有的细胞型发生凋亡时，DNA并不裂解为核小体倍数的小片段，在DNA电泳时，不出现梯形条带^［5］.

　　有别于凋亡的另一种细胞死亡形式即病理性坏死，除形态学上以胞体和细胞器肿胀、破溃为主而有别于凋亡外，在生化方面也有实质上的区别.其DNA断裂是非核小体连接部的、单或双链的、毫无规律的随机断裂，在DNA电泳时，呈现的是膜状条带^［2］.TNF是由单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的细胞毒因子，分别被命名为TNFα、TNFβ，由自然杀伤细胞产生的，被命名为TNF_γ.三者的氨基酸组成及来源有差别，但基因结构、染色体定位和生物学活性极为相似^［6］. tNF具有多种生物学活性，其诱导细胞凋亡是通过与靶细胞膜TNF受体结合后，激发细胞内一系列信号传递，引起Ca²⁺浓度增加，激活核酸内切酶，导致DNA降解，细胞凋亡^［7］.

　　国外学者用TNF诱导了乳腺癌^［8］、淋巴瘤^［9］、白血病细胞^［10］等的细胞凋亡.

　　在本实验中，用基因工程合成的TNFα作用于体外培养的人大肠癌Lovo细胞，经HE和Hoechst 33258染色，光学显微镜观察其形态改变为：胞体积缩小，核固缩、形态不规则，或呈浓染的颗粒状. 随TNFα 1×10⁸U/L作用12?!h～48?!h，凋亡百分率逐渐升高；作用48?!h，DNA电泳出现具有凋亡特征的梯形条带.而反复置-20℃的细胞，在DNA电泳时出现了坏死性膜状条带.

　　本实验提示了TNFα能够诱导人大肠癌Lovo细胞凋亡，并存在时间效应；为研究

　　tNF诱导细胞凋亡提供了信息，为临床应用TNF治疗肿瘤提供了理论依据.

　　梁卫江，女，1963-03-22生，广东省连州市人，汉族. 1984年第一军医大学医疗系本科毕业，硕士学位，主治医师.现为第一军医大学南方医院消化病研究所博士研究生，发表论文6篇.

　　通讯作者 梁卫江，510602，广东省广州市空军广州医院小儿内科.

　　Correspondence to: LIANG Wei-Jiang, department of Internal Medicine, Guangzhou

　　air Force Hospital, Guangzhou 510602, China

　　tel. +86·20·87705577-3093

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　　收稿日期 1997-08-01