大肠癌中nm23-H1、H2表达的研究
中国肛肠病杂志2000年第20卷第2期
北京军区总医院普外科（100700） 骆成玉 李世拥
北京医科大学人民医院 祝学光
提 要：应用定量RT-PCR技术，研究36例大肠癌标本中nm23-H1、H2基因的mRNA表达。结果显示：nm23-H1、mRNA表达显著高于正常大肠粘膜，DukesD期中其表达显著低于A、B、C期，有远处转移者其表达亦显著低于无远处转移者，nm23-H2mRNA表达与大肠癌临床病理无显著相关。提示nm23-H1可能参与大肠癌转移过程的调节。
关键词：大肠肿瘤；mRNA表达；nm23-H1；nm23-H2；肛肠病
nm23作为肿瘤转移相关基因至少存在H1和H2两种不同亚型。不少学者使用Northern印迹杂交或免疫组化法发现，一些人类恶性肿瘤如乳癌、肝癌转移表型的获得伴随着nm23表达的下降[1，2]。然而在另一部分肿瘤中nm23的研究与上述有悖[3，4]，大肠癌中所得的结论也有差异[5]，因而有必要使用更准确、灵敏的定量方法研究该基因的表达，并将它们与大肠癌临床病理相比较。乳癌、肝癌的几项研究还显示，nm23-H2与肿瘤临床病理及预后无明显相关[6，7，8]；卵巢癌和小细胞肺癌中H2与H1表达较为一致[9，10]。大肠癌中H2表达未见报道。我们应用RT-PCR定量技术对大肠癌中nm23-H1和H2基因的表达做了定量研究。
1 材料与方法
1.1 临床资料 36例大肠癌组织标本取自本院1994～1995年住院手术治疗的大肠癌患者，均经病理证实。男女各18例；年龄31～81岁，平均57.44岁。采取其中20例自身正常大肠粘膜（距肿瘤边缘＞10cm处）作正常对照线。标本置液氮保存备用。
1.2 总RNA提取及RT-PCR定量 参见文献报道[11]。β2-MG、β-肌动蛋白分别和于nm23-H1、nm23-H2内参对照。PCR循环在美国Idaho1605型气浴PCR仪上进行，94°C7s、55°C8s、72°C20s，共32个周期。反应产物取10μl行2%琼酯糖凝胶电泳、溴乙啶染色，紫外光下观察照相记录，见表1。
表1 实验用4对引物
| 基因 |
引物序列 |
扩增片段长度（bp） |
| Nm23-H1 |
5’-TTGAGCGTACCTCCATTACGATC-3’
5’-TTTGCACTCCACAGAATCACT-3’ |
366 |
| Nm23-H2 |
5’-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3’
5’-ATCTTCAAACCTCCATAGTG-3’ |
475 |
| β2-MG |
5’-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3’
5’-ATCTTCAAACCCCATAGTG-3’ |
120 |
| β-肌动蛋白 |
5’-ATCATGTTTGGGACCTTCAACA-3’
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’ |
318 |
1.3 光密度测定分析 摄影负片用光密度仪扫描，求nm23-H1、nm23-H2带分别与β2-MG，β-肌动蛋白带的比值。组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 大肠癌组织及正常大肠粘膜中nm23-H1、H2基因表达 见表1、2。20例正常大肠粘膜及36例大肠癌组织中nm23-H1、H2mRNA均有表达。
2.2 大肠癌组织中nm23-H1表达与大肠癌临床的关系 见表2。
表2 nm23-H1mRNA表达与大肠癌临床病理
| 项目 |
例数 |
x±s |
P值 |
| 正常大肠粘膜 |
20 |
0.37±0.18 |
|
| 大肠癌 |
36 |
1.16±0.32 |
＜0.01 |
| Dukes分期 |
|
|
|
| A |
3 |
1.18±0.18 |
|
| B |
18 |
1.23±0.35 |
|
| C |
10 |
1.25±0.26 |
|
| D |
5 |
0.69±0.19 |
＜0.01△ |
| 组织学分级 |
|
|
|
| 高分化 |
10 |
1.24±0.35 |
|
| 中分化 |
21 |
1.09±0.35 |
|
| 低分化 |
5 |
1.25±0.30 |
|
| 淋巴结转移 |
|
|
|
| 无 |
21 |
1.16±0.37 |
|
| 有 |
15 |
1.14±0.30 |
|
| 远处转移 |
|
|
＜0.01 |
| 无 |
31 |
1.23±0.30 |
|
| 有 |
5 |
0.69±0.91 |
|
| 血清CEA水平 |
|
|
|
| ＜15ng/ml* |
28 |
1.12±0.57 |
|
| ≥15ng/ml |
8 |
1.29±0.22 |
|
*我院正常值 △VS A、B、C
大肠癌组织中nm23-H1mRNA表达显著高于正常大肠粘膜（P＜0.01）；DukesD期中其表达显著低于A、B、C期（P＜0.01），与正常大肠粘膜中的水平相当（P＞0.05)；有远处转移者其表达亦显著低于无远处转移者（P＜0.01）；但nm23-H1mRNA表达水平与大肠癌组织分化程度、淋巴结转移及血清CEA水平之间均无显著相关。
2.3 大肠癌中nm23-H2表达 经摄影负片分析，癌组织中nm23-H2mRNA表达明显高于正常大肠粘膜，但各癌组织之间无明显不同。
3 讨论
已发现在多种动物模型及人类肿瘤中nm23-H1与转移抑制关系较大[4，12]。Bevilacqua等在研究人乳癌中发现，nm23-H1低表达与淋巴结转移、无病生存期、整体生存期及预后不良相关；有远睡转移的肝癌nm23表达弱于无远处转移者，转移灶处nm23低表达与肝癌的远处转移潜能紧密相联。然而，Engel在人肺癌、甲状腺癌中发现，进展期癌组织中nm23表达明显升高，nm23表达和患者无病生存率无关或负相关。
本研究应用RT-PCR定量技术在36例大肠癌组织及20例正常大肠粘膜中同样发现，国人正常大肠粘膜也有nm23 mRNA表达，但其表达水平却明显低于大肠癌组织。研究还显示，晚期、有远处转移大肠癌组织中nm23-H1mRNA表达明显降低，接近正常大肠粘膜中的水平。表明nm23-H1在人大肠癌组织中的表达情况与在乳癌、肝癌及甲状腺癌中的研究相似。提示nm23-H1基因表达与大肠癌远处或广泛转移呈负相关；nm23-H1mRNA表达水平的降低是人大肠癌进展的晚发事件。因此检测nm23-H1mRNA的表达可能对临床正确估计大肠癌患者的预后有着重要意义。临床上可针对癌组织中nm23-H1呈低表达的大肠癌患者进行严密随访并给予严格的术后化疗或其他综合治疗措施。
本研究对nm23-H2的检测未发现它与大肠癌各临床病理因素之间存在任何关联。说明大肠癌中nm23-H1mRNA表达与转移及恶性进展关系直接且明显，nm23-H1表达的程度能较为可信地反映大肠癌疾病进展。Tokunaga也发现，乳腺癌淋巴结转移与nm23-H1表达呈负相关，与nm23-H2无关[6]。Leone等将nm23-H1cDNA转染入人乳腺癌细胞进一步证实了nm23-H1转移抑制作用，同一实验将nm23-H1cDNA的转染却未见明确的抗转移效应[13]。这些结果提示，人nm23两个亚群在肿瘤细胞中可能各自调节，其生物学作用也不尽相同。
参考文献
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2.Yamaguchi A,Urano T,Fushida S,et al.Br J Cancer 1993；68：1020.
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11.骆成玉，祝学光，王申五.中华实验外科杂志1996；13（3）：157
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13.Leone A,Flatow U,Van-Houtte K,et al.Oncogene 1993；8:2325.
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