双歧杆菌对实验性大肠癌诱导型一氧化氮合酶表达的影响

　　中国微生态学杂志2000年第12卷第1期

王立生　潘令嘉　李明松　郑跃杰　孙勇　张亚历　周殿元

　　 摘　要：目的：用免疫组化法观察大肠癌移植瘤诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。方法：以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，将青春型双歧杆菌注射于裸鼠腹腔。结果：显示双歧杆菌注射组大肠癌移植瘤iNOS的表达率、表达强度和阳性细胞数量均显著高于肿瘤对照组(P＜0.01)。结论：青春型双歧杆菌能增强大肠癌移植瘤iNOS的蛋白表达水平。它的表达可能介导了双歧杆菌诱导大肠癌移植瘤细胞的凋亡。

　　 关键词：双歧杆菌　大肠癌　诱导型一氧化氮合酶

　　已知双歧杆菌在体内能抑制多种肿瘤的发生与发展，如Meth a纤维肉瘤、肝 癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤等^［1］。我们也发现青春型双歧杆菌对大肠癌裸鼠移植瘤的生长具有显著的阻抑作用，其抑瘤机制之一是诱导大肠癌移植瘤细胞发生凋亡^［2，3］。由于一氧化氮(Nitric Oxide,NO)在体内外也能通过诱导肿瘤细胞凋亡这一途径抑制多种肿瘤的生长。为进一步探讨双歧杆菌的抑瘤机理，本文以大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型，用免疫组化法观察了它在体内对大肠癌细胞诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物　BALB/c(nu/nu)，雄性，6～8周龄，体重约18g～22g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。

　　1.2　菌种来源及其培养　双歧杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养所得，经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型。实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱37℃培养72h，含菌培养液3000转/分离心10min，去上清，沉渣以PBS液洗三次，调细菌数为1×10¹⁰/ml。

　　1.3　大肠癌细胞株　Lovo细胞株为人未分化结肠癌细胞，引自本校病理教研室。按常规传代于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，生长至单层后，以0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞，调细胞数为1×10⁷/ml。

　　1.4　大肠癌裸鼠移植瘤模型的建立及双歧杆菌的处理措施　动物分为二组，(1)肿瘤对照组：20只裸鼠，实验的第1天于裸鼠的左前肢背部皮下接种Lovo细胞2×10⁶(0.2 ml)，第2天起于其腹腔注射PBS液0.2ml，每天一次，连续5天；(2)双歧杆菌注射组：20只裸鼠，实验第1天接种Lovo细胞的数量、部位及程序均同肿瘤对照组，第2天起向裸鼠腹腔注射双歧杆菌2×10⁹个(0.2ml)，每天一次，连续5天。于实验的第21天处死动物，剥离瘤体，将新鲜肿瘤组织固定于10%中性福尔马林溶液中，常规石蜡包埋，制片，行HE染色，组织学证实为未分化结肠癌。

　　1.5　免疫组化染色　染色程序按免疫组化SP法常规进行。鼠抗人iNOS单抗，生物素化马抗鼠IgG以及SP试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.6　观察指标及统计学处理　iNOS蛋白染色阳性切片分别以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中的阳性细胞数，每例计数10个网格，取其均值作为阳性细胞密度，以t检验行统计学处理。iNOS蛋白表达强度依其阳性产物着色深度分为4级：阴性(-)，弱阳性(+)，中等阳性(＋＋)，强阳性(＋＋＋)，两组之间蛋白表达强度的比较采用秩和检验进行统计学处理。

　　2　结　果

　　免疫组化结果显示，大肠癌裸鼠移植瘤iNOS蛋白阳性表达产物呈棕黄色，位于胞浆，背景清晰。肿瘤对照组大肠癌移植瘤的iNOS阳性细胞散在分布，数量较少，阳性细胞数量为46.76±11.54(个)，其表达多为阴性和弱阳性表达，表达率为45%；双歧杆菌注射组的iNOS阳性细胞亦为弥漫分布，阳性细胞数量为172.80±37.62(个)，显著高于肿瘤对照组( p＜0.001)，其表达强度多为中等和强阳性表达，表达率为80%，具体见表1。

表1　大肠癌裸鼠移植瘤中iNOS蛋白的表达强度和表达率

注：和肿瘤对照组相比，**P＜0.01，^△P＜0.01；和双歧杆菌注射组相比，*P＜0.01

　　3　讨　论

　　iNOS主要表达于激活的巨噬细胞中，它能催化左旋精氨酸形成NO。现已证明许多肿瘤细胞中也有iNOS的表达，如乳腺癌、肝癌、结肠癌和恶性胶质细胞瘤等。当这些肿瘤细胞受到细胞因子和紫外线等因素的刺激时，即能诱导其iNOS基因的表达，从而促进NO的产生。并且iNOS的表达水平和肿瘤的增殖、分化、凋亡和转移等重要生物学特性密切相关^［4］。Do ng等证实TNF-α、IL-1和IFN-γ在体外能促进K-1735小鼠恶性黑色素瘤细胞表达多量的iNOS，并俣成多量的NO，NO能直接作用于肿瘤细胞的DNA，使其硝基化并断裂，最终诱导它的凋亡，同时iNOS的表达水平和该肿瘤的转移潜能成锅相关^［5］。Jenkins等将iNOS cD NA转染至人结肠腺癌DLD-1细胞株中，得到可稳定持续分泌NO的细胞克隆，结果发现和野生型DLD-1细胞相比，转染iNOS的DLD-1细胞的凋亡率明显增高，其在体内外的生长速度亦明显减慢^［6］。本文结果中，双歧杆菌注射组大肠癌裸鼠移植瘤细胞的iNOS阳性表达率、表达强度和阳性细胞密度均显著高于肿瘤对照组，提示青春型双歧杆菌在体内能增强大肠癌细胞iNOS的蛋白表达水平。

　　双歧杆菌是终身定植于人体肠道内的最主要的生理性有益菌，在体内具有抗肿瘤、延缓衰老、抗感染和防辐射等多种重要功能。Sekine等发现婴儿型双歧杆菌的完整肽聚糖能明显抑制小鼠皮下移植的Meth A纤维肉瘤的生长^［1］。我们也证实青春型双歧杆菌在体内对大肠癌的生长具有明显的阻抑作用^［2］，其抑瘤机制主要有以下三点：(1)激活机体免疫系统中的巨噬细胞和NK细胞，使之分泌多量的具有杀瘤活性的IL-1、IL-6、IL-12和I fN-γ^［7］；(2)抑制肿瘤细胞的增殖^［2］；(3)诱导肿瘤细胞发生凋亡［3］。本文结果提示青春型双歧杆菌可通过提高大肠癌细胞iNOS的表达这一途径来诱导大肠癌细胞的凋亡。

　　作者简介：王立生(1968～)，男，主治医师，博士，研究方向为双歧杆菌的抗肿瘤作用及其机

　　制。

　　作者单位：王立生　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　潘令嘉　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　李明松　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　郑跃杰　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　孙　勇　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　张亚历　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　周殿元　第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州　510515

　　参考文献

　　［1］Sekine K,Ohta J,Ohnishi M,et al.Significance of bacterial structure of WPG related to antitumoral activity.Biotherapy,1990;6：329～335.

　　［2］王立生，潘令嘉，施理，等.双歧杆菌对实验性大肠癌的抑制作用及其机制的初步探讨.华人消化杂志，1998，6：456～457.

　　［3］王立生，潘令嘉，陈宏，等.双歧杆菌对实验性大肠癌凋亡的影响.中华医学杂志，1999，79：69～70.

　　［4］Sidney M,Morris JR,Billiar TR,et al.New insightinto the regulation of inducible nitric oxide synthesis.Am J Physiol,1994,266：E829～E839.

　　［5］Dong Z,Staroselsky AH,Qi X,et al.lnverse correlation between expression of inducible nitric oxide synthase activity and production of metastasis in k-1735 murine melanoma cells.Cancer Res,1994,54：789～793.

　　［6］Jenkins DC and Nathan C.Nitric oxide synthases：roles,tolls,and controls.Cell,1994,78：915～919.

　　［7］王立生，潘令嘉，施理，等.双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1、IL-6、IL-12的影响.中华微生物学与免疫学杂志，1998，18：373.