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氧化砷诱导食管癌细胞凋亡线粒体形态改变

氧化砷诱导食管癌细胞凋亡线粒体形态改变

  中华病理学杂志2000年第29卷第3期

  沈忠英 沈健 陈铭华 李乔山 洪超群

  摘 要 目的 通过研究食管癌细胞株SHEEC1细胞凋亡早期线粒体的形态改变和bcl-2、bax的表达,以了解三氧化二砷(As2O3)作用于食管癌细胞的机制。方法 食管癌细胞株SHEEC1用1、2、3μmol/L As2O3作用2、4、6、12、24 h。用Annexin-V荧光探针,流式细胞仪和DNA组方图检测早期凋亡细胞;光镜和电镜检测凋亡细胞的形态学改变;用罗达明(Rhodamin123)荧光探针检查活细胞线粒体的改变;用免疫组织化学SP方法检查bcl-2和bax的表达。结果 SHEEC1细胞经As2O3作用24 h出现细胞凋亡的典型形态改变。4 h可用Annexin-V查出早期凋亡细胞。线粒体的超微结构改变如下:As2O3作用2~4 h内线粒体增生,伴有电子密度高物质出现在基质,是早期细胞损伤的现象。作用6 h线粒体进行性肿胀,12 h出现气球样外观,甚至外膜破裂。不同剂量皆引起损伤脱落细胞bcl-2表达下调和bax上调。结论 由As2O3诱导的SHEEC1细胞凋亡,线粒体形态改变是早期改变,细胞凋亡和bax表达上调及bcl-2表达下调有密切关系。

  关键词:食管肿瘤;脱噬作用;线粒体;原致癌基因蛋白质c-bcl-2;肿瘤细胞,培养的

  近年来用三氧化二砷(As2O3)治疗急性白血病已引起们的重视[1,2]。其治疗机制是诱导肿瘤细胞凋亡[3,4]。我们曾报道As2O3诱导食管癌细胞凋亡,主要表现在细胞核超微结构改变[5,6]。最近我们发现As2O3诱导食管癌细胞凋亡过程中线粒体的改变[7]。我们拟通过研究As2O3诱导细胞凋亡的早期改变,重点在线粒体的形态改变及bcl-2、bax的表达,以阐明As2O3引起食管癌细胞凋亡的作用点,并证实As2O3是一种线粒体毒性药物。

  材料与方法

  1.细胞系和用药方法:食管癌细胞系SHEEC1是我室用HPV18 e6E7和TPA 协同诱导胚胎食管上皮恶性转化细胞[8],在M199培养基中加10%小牛血清培养传代。As2O3(Sigma公司产品, lot A1010)用培养基配成1、2、3 μmol/L。用药方法:细胞培养在250 ml培养瓶和24孔塑料培养板(Corning公司产品),内置盖玻片,每孔接种细胞5×104个,分1、2、3μmol/L 3浓度As2O3组及1组对照,在第2、4、6、12、24 h取标本检查。

  2.透射电镜检查:收获细胞离心成团,2.5%戊二醛固定,常规电镜制样,日立H-300电镜检查。

  3.流式细胞仪检查:DNA倍体测定按常规制样,碘化丙锭(propidium iodide ,PI)染色,检查细胞周期和凋亡峰。Annexin V检测:取培养细胞106用PBS洗,200 r/min离心5 min。Annexin-V-Fluos标记试剂盒购自Boehringer mannheim公司,按试剂盒方法作活细胞染色。流式细胞仪(FACSort,B-D公司)检测。

  4.罗达明123 (Rhodamin123,Rho123)荧光探针标记:Rho123, MW381 ,Molecular Probes公司产品。细胞在24孔板盖玻片上生长。1、2、3μmol/L As2O3作用,定时取片,PBS洗涤,Rho123(10μg/ml)染色,在37℃, 5% CO2培养箱温育30 min,PBS洗3次,在落射荧光显微镜(Nikon fluophot)下检查,激发光505 nm,发射光534 nm。

  5.免疫组织化学检查:用细胞离心机(Cytospin Ⅲ,美国Shandon公司)收集脱落细胞,4%多聚甲醛固定。bcl-2、bax兔抗多克隆抗体及SP免疫组织化学试剂盒(Santa cruz公司产品)购自北京中山生物技术公司,按试剂盒操作方法,并设阳性和阴性对照。脱落细胞另作苏木素细胞核染色。

  结果

  1.凋亡细胞的形态改变:SHEEC1加不同浓度As2O3后24 h均出现细胞凋亡,多数细胞核染色质凝集靠边呈典型凋亡细胞核改变(图1)。

  2.细胞凋亡的指标:1 μmol/L As2O3作用早期凋亡细胞较少,As2O32 μmol/L作用4 h Annexin V显示早期凋亡细胞占7.1%。DNA组方图显示细胞凋亡峰,12 h凋亡细胞7.5%,24 h凋亡细胞 35.0%。3 μmol/L As2O3作用细胞易进入凋亡后期改变。

  3.线粒体Rho 123荧光标记:加药后2 h线粒体数目增加, 4 h出现有粗大线粒体,多在胞质外带(图2)。12 h及24 h线粒体外形结构不清。

  4.细胞超微结构改变:不同浓度As2O3作用后2~4 h,线粒体数目增多,大小不一,椭圆形、双层膜和内嵴清晰(图3),有的线粒体肿胀,内嵴减少缩短,有电子密度高的不定形物质沉淀,细胞核染色质开始凝集(图4)。作用6 h可见线粒体肿胀,嵴消失;12 h外膜消失,基质透明呈气球样,并可见自噬泡。核染色质凝集成块及开始靠近核膜(图5),作用24 h细胞皱缩,核变圆,染色质凝集靠边,出现凋亡的改变(图6)。1μmol/L As2O3作用,病变发展较慢,而3 μmol/L As2O3作用病变发展较快,病变发生时间缩短。

  5.bcl-2和bax的表达:不同浓度As2O3作用2、6、12、24 h时收集细胞,bcl-2蛋白产物免疫组织化学检测呈阴性(图7),bax蛋白产物免疫组织化学染色呈深褐色,为高度表达(图8)。

  讨论

  细胞凋亡是一个发展的过程,有其早、中、晚期的改变,不同浓度的As2O3作用于SHEEC1细胞系4~6 h时出现凋亡早期改变:形态学上细胞完整,结构清晰,细胞核染色质轻度凝集,线粒体增多,肿胀,基质有致密物质沉积,有溶酶体自噬泡。Annexin-V染色流式细胞仪检查,证实磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外露。Rho123荧光探针显示在凋亡早期线粒体增生和肿胀。3 μmol/L As2O3作用24 h凋亡细胞出现晚期改变:多数细胞死亡,出现典型的细胞凋亡改变,如细胞皱缩,细胞核变圆,染色质凝集靠边,核膜不完整。线粒体空泡化或外膜破裂呈气球状,胞质呈退行性变。

  线粒体是细胞内一个重要的细胞器,是细胞进行呼吸链、电子传递,三羧酸循环和氧化磷酸化的场地,也是产生能量的场所,其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动[9]。线粒体膜通透性改变和跨膜电位改变使线粒体肿胀,位于线粒体内外膜间隙的细胞色素c进入胞质,激活某些蛋白酶系统(caspases)[10],是凋亡产生的起源。细胞核改变是核酸酶进入核内使染色质致密化和DNA断裂[11]

  Rho123是一种分子探针,属于慢反应膜电位荧光探针,用以检测线粒体内侧负电荷。它不但可以显示线粒体的形态,也可通过线粒体内荧光强度的改变,计算膜电位的增减,反映线粒体膜的通透性,是研究线粒体形态和功能的良好试剂。

  我们多次检查不同浓度As2O3作用于食管癌细胞系造成的损伤细胞,皆出现bcl-2表达下调和bax表达增加,证实这两者参与了细胞凋亡的过程。bcl-2可以预防细胞凋亡[12],bax能促进线粒体膜通透性改变,使细胞色素c释放引起细胞凋亡[13]。bcl-2/bax互相拮抗,其作用位置在线粒体,两者皆为细胞凋亡的调节基因。

图1 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3作用24 h出现多数凋亡细胞,细胞皱缩,细胞核变圆, 变小,染色质凝集成块,靠边 苏木素×400

图2 SHEEC1细胞加2 μmolAs2O3作用4 h活细胞Rhodamin荧光探针图象。左侧细胞线粒体增多,肿大,右侧改变不明显 Rho123×1000

图3 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3作用 6 h图像出现线粒体增多,分布不均,大小不一,膜结构和嵴保存,细胞核染色质未见凝集 ×15 000

图4 密集线粒体轻度肿胀,结构模糊,周围细胞质电子密度增加 ×20 000

图5 SHEEC1细胞加2 μmol As2O3作用6 h,线粒体肿大,内嵴消失,有的剩单层膜, 呈气球状,核染色质凝集 ×15000

图6 同上,24 h,细胞出现皱缩,染色质连结成块,靠边,胞质线粒体增多、变性 ×7 000

图7 As2O3作用6 h,损伤脱落细胞,bcl-2呈阴性 SP法×400

图8 同上,bax染色细胞质呈强阳性 SP法×400

  砷等氧化剂也作用在线粒体的膜转移电位,产生过量H2O2产物,使膜脂质过氧化作用和线粒体肿胀。我们研究证明As2O3诱导细胞凋亡,线粒体在药物作用4 h内即开始发生改变。核的改变晚于12 h。As2O3引起氧化应激(oxidative stress)毒性作用可能是通过线粒体膜通透性和膜电位改变,也可使bcl-2和bax表达异常而产生细胞凋亡。因此认为As2O3具有线粒体毒性,可用于治疗食管癌。

  作者单位:沈忠英(515031汕头大学医学院病理学研究室)

  沈健(515031 汕头大学医学院病理学研究室)

  参考文献

  1 孙鸿德,马玲,胡晓晨,等. 癌灵1号结合中医辩证治疗急性早幼粒细胞白血病32例.中国中西医结合杂志,1992,12:170-171.

  2 Chen GQ, Zhu J, Shi XG, et al. In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (As2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemia: As2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RAR alpha/PML proteins. Blood, 1996,88:1052-1061.

  3 Look AT. Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia. J Natl Cancer Inst, 1998,90:86-88.

  4 Shao W, Fanelli M, Ferrara FF, et al. Arsenic trioxide as an inducer of apoptosis and loss of PML/RAR alpha protein in acute promyelocytic leukemia cells. J Natl Cancer Inst, 1998, 90:124-133.

  5 沈忠英,谭立军,蔡维佳,等.氧化砷诱导食管癌细胞系细胞凋亡的形态学研究.华消化杂志, 1998,6:226-229.

  6 Shen ZY, Tan LJ, Cai WJ, et al. Arsenic trioxide induces apoptosis of oesophageal carcinoma in vitro. Int J Mol Med, 1999,4:33-37.

  7 Shen ZY, Shen J, Cai WJ, et al. The alteration of mitochondria is an early event of arsenic trioxide induced apoptosis in esophageal carcinoma cells.Int J Mol Med, 2000,5:155-158.

  8 沈忠英,蔡维佳,沈健,等. HPV18E6E7诱发胚食管上皮永生化和TPA协同诱发恶性转化的研究. 病毒学学报,1999,15:1-7.

  9 Kunz-Schughart LA, Habbersett RC, Freyer JP. Mitochondrial function in oncogene-transfected rat fibroblasts isolated from multicellular spheroids. Am J physiol,1997,273(5 pt l):C1487-1495.

  10 Bossy-Wetzel E, Newmeyer DD, Green DR. Mitochondrial cytochrome c release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization. EMBO J,1998,17:37-49.

  11 Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor or ICAD. Nature,1998,391:43-50.

  12 Rosse T, Olivier R, Monney L, et al. Bcl- 2 prolongs cell survival after bax-induced release of cytochrome c. Nature, 1998,391:496-499.

  13 Pastorino JG, Chen ST, Tafani M, et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition. J Biol chem,1998,273:7770-7775.


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