三磷酸腺苷对人胃癌细胞恶性表型的去恶化作用

中华肿瘤杂志 1999年第3期第21卷 基础研究

作者：郝纯毅　吕桂芝　蔡险峰　林仲翔

单位：100034 北京医科大学临床肿瘤学院

　　关键词： 三磷酸腺苷；胃肿瘤；微绒毛；微丝；纽蛋白

　　【摘要】　目的　观察三磷酸腺苷(ATP)对人胃癌M17细胞系增殖和分化的影响。方法　应用三磷酸腺苷作用于人胃癌M17单细胞克隆亚系，每日记数细胞和计算抑制率，用扫描电镜观察M17细胞膜表面微绒毛变化，罗氏黄荧光染料传输法观察细胞间隙连接通讯功能的状况，纽蛋白（vinculin）和微丝蛋白双标记法观察微丝骨架和粘着斑组装的变化。结果　（1）ATP对人胃癌细胞的增殖有明显的抑制作用，加药处理4天后增殖的抑制率可达80%以上。（2）ATP有促进M17细胞罗氏黄荧光染料传输的作用，表明细胞间隙连接通讯功能的恢复。（3）ATP作用后的M17细胞F-肌动蛋白小体消失，微丝束重组。M17细胞边缘纽蛋白粘着斑在ATP的作用下出现。结论　ATP不仅抑制人胃癌细胞的增殖，而且诱导分化，使人胃癌细胞的恶性表型向正常表型逆转。微绒毛的存在和间隙连接通讯、微丝束、纽蛋白粘着斑的缺乏是人胃癌细胞的重要标记。

Effect of ATP on malignant phenotype of a human gastric cancer cell line

HAO Chunyi, LU Guizhi, CAI Xianfeng, et al.

　　School of Clinical Oncology, Beijing Medical University, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100036

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of ATP on proliferation and differentiation of a human gastric cancer cell line.Methods　M17, a subclone of human gastric cancer cell line MGC-803, was treated in vitro with ATP(0.23 mg/ml). After 48 hr, the following parameters were examined. (1) Proliferation of cells by daily cell counting. (2) Microvilli of the cells were observed by scanning EM. (3) Gap junction intercellular communication was examined by mechanical scraping and Lucifer dye transfer. (4) Microfilament of the cytoskeleton was studied with fluorescin-labeled phalloidin. (5) Vinculin adhesion plague was stained immunocytochemically with monoclonal antibodies.Results　ATP significantly inhibited the in vitro growth of M17 cells. The ATP-treated M17 cells showed disappearance of microvilli on the cell surface, increased gap junction intercellular communication, improved organization of microfilament bundles and reappearance of vinculin adhesion plagues.Conclusion　ATP not only inhibits proliferation but also induces differentiation of a human gastric cancer cell line with reversion from malignant toward normal phenotype. The parameters examined could serve as useful bio-markers of human gastric cancer.

　　【Subject words】　Adenosine triphosphate　　Stomach neoplasms　　Microrilli　　Microfilament　Vinculin

　　肿瘤组织一般含有许多表型差异的细胞亚群，M17人胃癌单细胞克隆亚系是由人胃癌细胞系（MGC-803）分离的生长快、分化差、恶性表型明显的细胞系^［1］。胃癌在我国发病率高，临床特征不明显，不易早期发现，缺乏主要标志和有效的治疗药物。三磷酸腺苷(ATP)对人胃癌细胞增殖有明显的抑制作用^［2,3］，我们选用ATP作用于M17人胃癌细胞，观察其表型变化，探讨ATP的抗癌作用机理。

　　材料与方法

　　1． 细胞培养和处理：用有限稀释法由胃癌细胞母系MGC-803分离出M17单细胞克隆亚系，经传15代后仍保持增殖快、分化差等恶性表型。把M17细胞（10⁴/ml）接种于含15%小牛血清RPMI 1640培养瓶内，次日加入ATP（0.23 mg/ml）作为实验组；对照组细胞不用ATP处理。各组细胞设2瓶，每日更换培养液（实验组含ATP），每日用白血球计数器计数细胞，每瓶细胞计数2次。上述实验重复两次，取均值，计算抑制率并绘制生长曲线。

　　2． 扫描电镜样品制备：将两组细胞（盖片）经2%戊二醛和锇酸双固定，然后再经醋酸异戊酯置换，经临界点法干燥，用1B-5型离子镀膜仪镀金，扫描电镜下观察。

　　3． 罗氏黄（lucifer yellow, LY）荧光染料传输法：密度饱和的两组单层培养细胞，用锐刀划痕标记罗氏黄（0.05%LY/PBS）3分钟，洗去染液，立即在荧光显微镜下检查荧光从标记细胞向邻近细胞层传输的级数，表示细胞间隙连接通讯功能。

　　4． 微丝与粘着斑蛋白-纽蛋白(vinculin)复染：细胞盖片中经PBS洗1次，固定于2%甲醛/PBS中3分钟，再用0.5%TritonX-100/PBS 抽提30分钟，细胞与vinculin单抗（Sigma公司）和FITC-羊抗鼠IgG二抗先做反应，各组洗涤同前，用专一性结合F-肌动蛋白的荧光染料罗丹明-鬼笔环肽（Mol Probes公司)染微丝，用DAPI(4,6-diamidino-2-phyenylindol, Sigma公司)染核后，用60%甘油PBS封片。在落射Olympus荧光显微镜下观察、拍照。

　　结果

　　1．增殖的抑制表现：M17单细胞克隆亚系经传15代后恶性表型稳定,增殖速度快。经ATP作用后，增殖速度明显减慢。24小时后对照组的细胞数为3.6×10⁴/ml，实验组的细胞数为3.1×10⁴/ml，增殖的抑制率为13%；48小时后对照组的细胞数为7.16×10⁴/ml，实验组的细胞数为4.06×10⁴/ml，增殖的抑制率为43%；72小时后对照组的细胞数为10.28×10⁴/ml，实验组的细胞数为4.18×10⁴/ml，增殖的抑制率为67%；96小时后对照组细胞数为14.45×10⁴/ml，实验组的细胞数为4.56×10⁴/ml，增殖的抑制率为87%。说明ATP对M17细胞增殖有明显的抑制作用。

　　2.膜表面微绒毛明显改变：M17细胞表面密布微绒毛（图1），经ATP作用48小时后，M17细胞膜表面较光滑平坦，微绒毛消失（图2），具有正常细胞的表型特征。

　　3.细胞间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)功能的恢复：M17细胞间隙连接通讯功能缺陷，LY荧光染料留在划痕创面不向临近细胞层传输(图3)。经ATP（0.23 mg/ml）处理48小时的M17细胞，LY荧光从标记的划痕创面向邻近细胞层传输3～4层（图4），表明ATP促进了M17细胞间隙连接通讯功能的恢复。

　　4． 微丝骨架重组和膜粘着斑蛋白-纽蛋白的表达：人正常胃粘膜细胞内微丝形成束状纤维，粗壮而密，纵横交错贯穿整个胞质区形成网络。应力纤维末端终止于膜与底质附着区内面的粘着斑，vinculin荧光染色粘着斑呈泪滴状。M17的微丝骨架破坏，应力纤维消失，鬼笔环肽荧光显示F-肌动蛋白小体出现（图5）；而在ATP作用48小时的M17细胞膜内，微丝束粗壮，纵横交错贯穿整个胞质区（图6）。M17细胞vinculin荧光染色为稀疏小点，粘着斑消失（图7）；而ATP处理48小时的M17细胞vinculin荧光染色的粘着斑整齐有序地排列在膜内面（图8），近似正常人胃粘膜细胞的粘着斑。

1　M17细胞膜表面密布绒毛（扫描电镜，×3 000）　图2　ATP作用后的M17细胞膜表面光滑平坦（扫描电镜，×8 300）　图3　罗氏黄荧光染料示踪技术显示M17细胞间隙边接通讯功能丧失，Ly荧光染料停留在划痕创面不传输（×760）　图4　罗氏黄荧光染料示踪技术显示M17细胞细胞间隙边接通讯功能上调，Ly荧光染料停留在划痕创面不传输3～4层（×760）　图5　罗丹鬼物环肽技术显示M17细胞微丝束破坏，微丝蛋白呈肌动蛋白小体状排列在膜 下细胞浆内，如箭头所示（×1210）　图6　罗丹鬼物环肽技术显示M17细胞经ATP作用后微丝束组装改善沿细胞膜下纵向排列（×1210）　图7　免荧光技术显示M17细胞膜边缘vinculin不表达，呈阴性反应（×1210）　图8　免荧光技术显示，ATP处理的M17细胞粘着的主要粘着蛋白vinculin整齐有序地排列在膜内面，如箭头所示（×1210）

　　讨论

　　微绒毛是癌细胞膜表面的重要标志^［4］，癌细胞借微绒毛扩大表面的吸收面积以适应代谢和生长的需要，ATP作用下的M17细胞表面光滑平坦，说明M17细胞在ATP作用的分化逆转是结构和功能统一的表现。

　　GJIC参与细胞生长和分化的调控，增殖旺盛和生长失控的肿瘤细胞GJIC功能低下或被抑制，成体组织的正常细胞都有GJIC，近来更有报道GJIC受间隙连接蛋白基因（connexin, CX）调控。ATP上调了M17细胞的GJIC，是否与CX基因表达相关，我们将进一步进行研究，以阐明CX基因与GJIC之间关系。

　　癌细胞微丝结构破坏，可能干扰了膜蛋白的转移和转换，导致膜间隙连接结构的减少或关闭，从而使细胞GJIC功能低下或抑制^［1］，也可能是GJIC的抑制，导致细胞间信使分子的交流平衡失调，从而影响细胞骨架的装配^［5］。GJIC和微丝骨架的装备呈正相关性。M17细胞微丝骨架破坏、GJIC抑制和F-肌动蛋白小体的出现均表明癌细胞恶性表型与增殖失控恶性行为有关^［6］。ATP的去恶化呈现出的微丝束重组和GJIC恢复则提示这些结构和功能相互制约和相互促进的平行关系。

　　vinculin是细胞表面粘着斑内的主要粘着蛋白，一端与细胞内的微丝相联，另一端与细胞外基质（通过其他粘着分子）相接，对微丝的稳定、细胞的粘附作用以及生长分化的信号传导都起着重要作用。最近有文献报道转化（或肿瘤）细胞微丝结构的破坏与微丝及粘着斑蛋白基因的调控有关^［7］。粘着斑是多种蛋白分子的复合体（α-actinin、tensin等），共同参与细胞生长和分化的调控，起着抑制基因的作用。转化细胞一般不表达或低表达vinculin、α-actinin、tensin等，以其转染的转化细胞可使恶性表型逆转^［8］。ATP作用下的M17细胞vinculin高表达，表明M17细胞的恶性表型逆转是ATP对M17细胞去恶化作用又一重要表型特征，我们将进一步研究粘着斑内其他粘着分子的相关作用，以阐明ATP去恶化作用的分子机理，为临床开辟ATP治疗癌症提供依据。

　　本课题受国家和北京市自然科学基金资助

　　参考文献

　　1　韩亚玲，张志谦，蔡险峰，等.生长特性差别的胃癌MGC-803细胞亚系间细胞骨架、细胞通讯与癌基因表达的比较研究.实验生物学报，1996，29：13-23.

　　2　吕桂芝，高燕，黄衍川，等.外源性三磷酸腺苷对人胃腺癌SGC-7901细胞的生物学效应.解剖学报，1988，19：278-281.

　　3　吕桂芝，林仲翔，孟松娘，等.三磷酸腺苷对胃癌细胞Na⁺-K⁺-三磷酸腺苷酶活性和C-myc基因表达的影响.中华医学杂志，1995，75：563-564.

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　　5　Sacz JC, Connor JA,Spray DC,et al. Hepatocyte gap junctions are permeable to the second messenger， Inositol 1, 4, 5 trisphosphate and to calcium ions. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86:2708-2712.

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　　7　Fernandez JLR,Geiger B, Salomon D, et al. Suppression of tumorigenicity in transformed cells after transfection with vinculin cDNA. J Cell Biol,1992,119:427-438.

　　8　Ben-Ze′er A. Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors. Curr Opin Cell Biol, 1997,9:99-108.

收稿：1998-06-04　　修回：1998-08-06