胃癌中Cyclin D1和p53蛋白的表达及意义

中国肿瘤临床与康复 2000年第2期第7卷 临床研究

作者：金顺花　朴熙绪　金海燕　金永日　许强

单位：金顺花(吉林省延边大学医学院附属医院消化内科 吉林 延吉 133000)；朴熙绪(吉林省延边大学医学院附属医院消化内科 吉林 延吉 133000)；金海燕(吉林省延边大学医学院附属医院消化内科 吉林 延吉 133000)；金永日(吉林省延边大学医学院附属医院消化内科 吉林 延吉 133000)许强(吉林省延边大学医学院附属医院消化内科 吉林 延吉 133000)

关键词：胃癌；Cyclin D1；p53蛋白

　　〔摘要〕　目的　检测72例胃癌和癌旁组织及20例正常胃粘膜中的Cyclin D1和p53蛋白，探讨它们在胃癌发生、发展中的作用及意义。方法　采用链菌素亲生物素——过氧化物酶法(SP法)。结果　胃癌组织中Cyclin D1和p53蛋白总阳性表达率分别为47.22%和52.78%，与癌旁组织或正常对照胃粘膜组织比较均有非常显著性差异(P＜0.01)；二者均与胃癌分化程度有关，其中p53蛋白表达与肿瘤深度，淋巴结转移，远处转移等因素有明显相关(P＜0.01)，但Cyclin D1表达与之无关(P＞0.05)。胃癌中Cyclin D1与p53蛋白表达呈正相关(r=+0.45)。结论　Cyclin D1与p53蛋白过表达与胃癌的发生，分化有关，其中Cyclin D1过表达是胃癌发生过程中一个较早的分子事件，而p53蛋白过表达是相对较晚的分子事件，可做为早期诊断，判断预后和胃癌分化程度的一个参考指标。

　　〔中图分类号〕　R735.2　〔文献标识码〕A

Expression and significance of Cyclin D1 and p53 in gastric cancer

JIN Shun-hua, PIAO Xi-xu, XU Qiang

　　(Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital,Yanbian medical college,Jilin 13300)

　　〔Abstract〕　Objective　To detect Cyclin D1 and p53 in gastric mucosa of gastric cancer,and its adjacent tissue and normal gastric tissue and to probe into their roles in the occurrence and development of gastric cancer.Methods　 SP assay was performed.Results　The total positive rates of Cyclin D1 and p53 in gastric cancer were 47.22% and 52.78% respectively,which had significant difference compared with the adjacent tissue to cancer and normal mucosa (P＜0.01).Both Cyclin D1 and p53 had relation to the differentiated degree of gastric cancer.P53 related with the depth of tumor,lymphatic metastasis and distal metastasis (P＜0.01),while Cyclin D1 didn′t (P＞0.05).The expression of Cyclin D1 and p53 had positive relation (r=+0.45)Conclusions　The over expression of Cyclin D1 and p53 related with the ocurrence and differentiation of gastric cancer in gastric cancer.The expression of Cyclin D1 was an earlier event.whereas the expression of P53 was a relatively later event in the occurrence of gastric cancer.Both of them could be taken as a reference in the early diagnosis,prediction of prognosis and judgment of differentiated degree of gastric cancer.

　　〔Key words〕　gastric cancer;Cyclin D1;p53

　　细胞周期与细胞癌变的关系是近年来生命科学研究中热门课题之一。研究表明，细胞周期调控异常与细胞癌变密切相关。我们应用免疫组化SP法对72例胃癌组织的Cyclin D1和p53蛋白进行检测，结合胃癌病理学特征进行分析，以期阐明细胞周期与细胞癌变的关系，探讨它们在胃癌发生，发展中的作用。

　　材料和方法

　　一、实验材料　本院1994～1997年手术切除，病理确诊的胃癌72例，取材后用10%福尔马林固定，石蜡包埋，制成5um厚切片。经HE染色和组织学观察，按WHO标准分类：管状腺癌46例，粘液癌21例，未分化癌5例。病理学分级和PTNM分期按国际抗癌协会标准。对照组用20例正常胃粘膜活检标本。

　　二、方法　采用免疫组化SP法。SP试剂盒购于北京中山公司，为Zymed公司产品，其中鼠抗人Cyclin D1、p53蛋白单克隆抗体为Santackvj公司产品，Ⅱ抗和Ⅲ抗为美国Vectorcr公司产品。

　　主要步骤如下：石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PBC洗 5分钟；3%H202 10分钟，PBS洗5分钟；10%小山羊血清15分钟，微波抗原修复；一抗(Cyclin D1为 1∶20，p53为1∶50)室温过夜，PBC洗5分钟；生物素标记二抗(1∶150)15分钟，PBS洗5分钟；SP(1∶150)15分钟，PBS洗5分钟；DAB显色5～10分钟，自来水充分冲洗；苏木精复染；脱水、透明、封固。用已知阳性对照片做为阳性对照，用PBS代替一抗作为阳性对照。

　　三、结果判定　阳性细胞显棕黄色或棕褐色，且强度高于本底。

　　结果

　　一、胃癌和癌旁组织中Cyclin D1和p53蛋白表达　表1示Cyclin D1和p53蛋白在胃癌组织中总阳性表达率明显高于癌旁组织或正常对照胃粘膜(P＜0.01)，其中管状腺癌阳性率均低于粘液癌，但二者间差异无显著性(P＞0.05)。值得注意的是5例未分化癌，无1例p53蛋白表达，而Cyclin D1 100%表达。Cyclin D1和p53蛋白阳性率在癌旁组织中不典型增生、肠上皮化生，正常上皮各组间比较无显著性差异(P＞0.05)。

表1　Cyclin D1,p53蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达［阳性例数(%)］

　　**与癌旁组织或正常对照胃粘膜相比P＜0.01

　　二、Cyclin D1和p53蛋白的表达与胃癌分化程度及PTNM分期的关系　表2示胃癌Cyclin D1、p53蛋白的表达与病理学分级有明显相关，随分化程度降低阳性表达率均明显升高，即低分化癌表达明显高于高、中分化癌，5例未分化癌无1例p53蛋白表达，而Cyclin D1 100%表达；差异有非常显著性(P＜0.01)。胃癌p53蛋白表达与肿瘤深度，淋巴结及远处转移等因素有明显相关，但Cyclin D1表达与之无明显相关性。

　表2　Cyclin D1、p53蛋白的表达与胃癌分化程度及PTNM分期关系［阳性例数(%)］

　　^**与低分化癌组比较P＜0.01；^△△与T₃-T₄组比较P＜0.01；^▲▲与N₁-N₂组比较，P＜0.01；^##与M₁组比较P＜0.01。

　　三、胃癌中Cyclin D1与p53蛋白表达的关系　表3示胃癌中Cyclin D1与p53蛋白的表达呈正相关(r=+0.45)。

表3　胃癌中Cyclin D1与p53蛋白表达的关系

　　四、Cyclin D1，p53蛋白在组织中的分布情况　Cyclin D1以胞浆着色为主，呈弥漫性或颗粒性，偶见胞核着色，p53以胞核着色为主，偶见胞浆着色。

　　讨论

　　胃癌的早期发生机理尚不清楚，开展与细胞周期调控有关的基因研究是揭示致癌机制的重要途径。Cyclin D1和p53通过调控细胞周期中的G1/S期转变，调节细胞凋亡和细胞增殖，参与肿瘤的发生和浸润转移。细胞周期蛋白(Cyclins)目前发现有8个成员，分别命名为CyclinA-H。分别在细胞周期不同时期程序性地合成和释放。它们作为调节亚基，需与催化亚基CDK形成复合物，在细胞周期的相应时期发挥调节作用。目前研究较多者为Cyclin D和CyclinE。CyclinD分为D1，D2，D3三个亚型，分别由11q³的CCND1，12p¹³的CCND2和6p²¹的CCND3基因编码，其表达在某些细胞是特异的，或表达D3，或表达D1，D2。如在人甲状腺癌中观察到甲状腺素基因(PRAD1)与D1融合基因的表达，其后在B细胞淋巴瘤、乳腺癌、食道癌中也有D1的过表达^［1］，它们分别是染色体倒置inv(11)(p¹⁵；p¹³)，染色体量位(11，14)(q¹³；q³²)和染色体11q13区PRAD基因扩增的结果。我们研究结果显示Cyclin D1在胃癌组织表达的总阳性率为47.22%，明显高于癌旁组织或正常对照胃粘膜(P＜0.01)，提示Cyclin D1过表达与胃癌发生有关。在G1期Cyclin D1与CDK4结合，使后者激活，活化的CDK4可使RB磷酸化，失去抑制EZF(细胞转录活化因子)的启动DNA合成作用，使细胞由G1→S期，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡而癌变。随分化程度的降低Cyclin D1阳性表达率明显升高，即低分化癌组明显高于高、中分化癌组，可做为判断胃癌分化程度的一个参考指标，但与肿瘤深度，淋巴结转移，远处转移等因素无明显相关性，说明Cyclin D1异常表达可能是胃癌发生过程中一个较早的分子事件，而与肿瘤进展无明显相关。胃粘膜上皮病变是一个非常缓慢的过程，这个进展间期就提供了一个抑制其发展的良好机会。因此Cyclin D1同时具有早期诊断和治疗的价值。

　　p53基因定位人类第17号染色体短臂(17q^13.1)，其产物为53KDa的核内磷酸蛋白，它分为野生型和突变型。研究发现突变型p53蛋白在胃癌组织表达的总阳性率为52.78%，明显高于癌旁组织或正常对照胃粘膜。提示p53蛋白过表达与胃癌发生有关。这种p53蛋白异常表达率依正常，癌前病变，癌的顺序递增，说明胃粘膜癌变过种中p53基因作用与突变量和表达量积累有关。p53突变主要发生于p53的DNA结合部位，突变使p53失去与DNA结合和正常的生物活性^［2］。即突变型p53失去了对细胞的监视作用，含有损伤DNA的细胞在G1期被“漏检”，从而进入S期增殖，其结果是细胞因子遗传的不稳定性而产生突变或染色体畸变，最后发生癌变。胃癌p53蛋白过表达与胃癌分化程度，肿瘤深度，淋巴结转移，远处转移等因素有明显相关，提示p53蛋白过表达是胃癌发生过程的一个相对较晚的分子事件，与肿瘤进展有关。可做为判断胃癌分化程度，预后的指标之一。

　　我们研究发现胃癌p53蛋白与Cyclin D1的表达呈正相关。二者可能通过调控P21，相互起作用。p21是p53下游的靶分子，p21启动子有p53结合位点，p21基因(WAF1/Cip1)转录被野生型p53活化，尽管p21也同样受其他转录因子调节，但p21是p53介导细胞周期停止所必需。当DNA损伤时，p53被活化，继而p21的量增加，导致Cyclin D1配体抑制，防止细胞进入S期。当p53突变，缺乏功能性p53表达的细胞，在DNA损伤后不能诱导p21转录，激活Cyclin D1，使带有损伤DNA的细胞进入S期，得以复制，从而提高了染色体畸变的偶发率和遗传的不稳定性而癌变^［3］。通过检测Cyclin D1、p53，研究细胞周期与癌变之间关系，不仅有助于揭示肿瘤的发生机理，而且为肿瘤的诊断，防治可提供新思维方法。

　　作者简介：金顺花(1971-)，女，延吉市人，硕士，主治医师。从事肿瘤消化内科专业。

　　参考文献

　　1，HunterT.Cylins and Cancer Ⅱ:CyclinD and CDK inhibitors core of age.Cell,1994；79:573

　　2，Zambetti Gp and Levine AJ.A comparison of the biological activation of wild-type and mutant p53.FASEB J.1993；17:855

　　3，郭德玉.细胞周期调控与癌变.国外医学生理.病理科学与临床分册，1997；17(1)：1-4

收稿日期：1999-7-26