细胞色素p450 2C19基因多态性与胃癌易感性的关系

中国肿瘤临床 2000年第7期第27卷 论著

作者：赵筱萍　李汉植　杜晓依　周翔　陈枢青

单位：赵筱萍(浙江省卫生学校　杭州市　310009)；李汉植(浙江省永康市第一人民医院)；杜晓依(浙江大学医学院)；周翔(浙江大学医学院)；陈枢青(浙江大学医学院)

关键词：胃肿瘤；细胞色素p450 2C19；基因多态性

　　摘要　目的：研究细胞色素p4502C19基因多态性与胃癌易感性的关系。方法：用PCR-RFLP法对100例健康对照者和50例胃癌患者进行CYP2C19等位基因多态性分组分析。结果：胃癌患者中CYP 2C19 PM发生率为28.0%，较正常对照组的14.0%高，经统计，两组间有显著性差异(χ²=4.30，P＜0.05)。结论：CYP2C19 PM增加了胃癌发生的危险性，实验结果提示CYP 2C19参与了胃癌致癌物的灭活。

The Relationship between Cytochrome p450 2C19 Genetic Polymorphism and Gastric Cancer susceptibility

Zhao Xiaoping　Li Hanzhi　Du xiaoyi et al(Teaching and Research Group of Biochemistry, Zhejiang　Hygiene school,Hangzhou)

　　Abstract　Objective:To study the relationship between cytochrome p450(CYP 2C19) genetic polymorphism and gastric cancer susceptibility.Method:The polymorphism of CYP 2C19 gene in100 healthly controls and 50 gastric cancer patients were investigated by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism.Results:The frequency of CYP 2C19 PM in gastric cancer was 28.0%, which was higher than that of controls 14.0%.Statistric results showed a very significant difference(χ²=4.30,P＜0.05).Conclusion:CYP2C19 PM may increase the risk of gastric cancer. This result suggests that CYP2C19 be involved in the inactivation of carcinogen of gastric cancer.

　　Key Words　Gastric neoplasm　Cytochrome　p450 2C19　Gene polymorphism

　　1984年，Wedlund^［1］等报道美芬妥英羟化代谢在人群中存在着遗传的多态性，羟化速度快者为快代谢者(extensive metabolism,EM)，羟化速度慢者为慢代谢者(poor metabolism,PM)。1993年，Wrighton^［2］等从人类肝脏中分离出一种酶并命名为CYP2C19，提出CYP 2C19即为美芬妥英羟化酶。1998年，陈枢青^［3］等研究发现，CYP2C19 PM增加了患肺癌(主要是鳞状细胞癌)的危险性，而患膀胱癌(主要是移行细胞癌)的危险性则较低，说明CYP2C19对不同器官及不同种类的肿瘤所起作用不同。本研究通过对胃癌组和对照组CYP2C19等位基因进行基因分型，以阐明CYP 2C19基因多态性与胃癌易感性的关系。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　50例胃癌患者来源于浙江省肿瘤医院、浙江大学医学院附属第一医院、附属邵逸夫医院临床确诊的胃癌手术患者；100例正常健康受试者来源于志愿献血者，要求年龄和吸烟状态与胃癌组基本相近。每位受试者抽静脉血2ml，EDTA抗凝，用于提取DNA。

　　1.2　DNA提取

　　对Chen等^［4］的方法进行改进，提取EDTA抗凝血中白细胞的DNA，取2ml外周血于7ml的离心管中，加2ml tKM1(内含10mmol/L Tris-HCI,pH7.6,10mmol/L MgCl₂，2mmol/L EDTA)和0.05ml igepal CA-630振摇直至lgepal全部溶解。4℃×3 000r/分钟条件下离心10分钟。倾去上清液，留下的沉淀用TKM1清洗，继续上述条件离心。倾去上清液，沉淀中加入0.32ml tKM2(内含10mmol/L Tris-HCI,pH7.6,10mmol/L MgCl₂,2mmol/L eDTA,0.4mol/L NaCl)，加10%SDS充分摇匀，放在55℃水浴约10分钟，至沉淀全部溶解。用冰浴冷却，加0.12ml naCl后再冰浴。4℃×10 000r/分离心10分钟，取上清液，加无水乙醇，摇晃试管至DNA析出，用玻棒转移DNA，并用70%乙醇清洗，把DNA悬浮于TE缓冲液中，4℃保存，备用。

　　1.3　CYP 2C19基因分型

　　参照de Morais的基因分型法^［5，6］，利用PCR-RFLP法对CYP2C19等位基因进行分析^［7］。测定CYP 2C19m1型突变基因时所使用的引物是F15′-AAT tAC AAC CAG AGC TTG GC-3′，R1 5′-TAT CAC TTT CCA TAA AAG CAA G-3′；测定CYP2C19m2型突变基因时所使用的引物是F2 5′-TAT TAT TAT CTG TTA ACT AAT aTG A-3′，R2 5′-ACT TCA GGG CTT GGT CAA TA-3′。PCR扩增的条件：m1位点扩增条件是94℃×1分钟、57℃×1分钟、72℃×1分钟35个循环，最末72℃×10分钟。m2位点扩增条件是94℃×1分钟、53℃×1分钟、72℃×1分钟35个循环，最末72℃×10分钟。

　　2　结果

　　利用PCR-RFLP法对CYP 2C19进行基因分型，电泳结果见图1，2。

1、5道为标准分子量DNA样品，2道为CYP2C19ml野生型纯合子(wt/wt)，3道为CYP 2C19m1突变型杂合子(wt/m1)，4道为CYP2C19m1突变型纯合子(m1/m1)

　　图1　CYP 2C19基因分型的典型结果

4道为标准分子量DNA样品，1、6、7道为CYP2C19m2突变型杂合子(wt/m2)，2、3、5道为CYP 2C19m2野生型纯合子(wt/wt)，未检测到CYP2C19m2突变型纯合子图2　CYP 2C19m2基因分型的典型结果

　　对100例健康受试者和50例胃癌患者进行CYP2C19基因分型，结果见表1，2。

表1　对照组和胃癌组CYP 2C19各种基因型例数

表2　胃癌组与对照组CYP 2C19快、慢代谢者统计结果

　　χ²＝4.30，P＜0.05，相对危险性(OR)＝2.39，95%可信度(CI)：1.04～5.523　讨论

　　胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在国内仍占癌症的首位^［8］。胃癌的发生、发展是一个多基因变异累积的过程，涉及多种癌基因、抑癌基因和肿瘤易患基因的异常。

　　CYP 2C19基因定位于染色体10q24，参与一些药物和外源性物质的代谢。1994年，de morais等^［5，6］在日本美芬妥英慢代谢人群中发现了两个等位基因的突变位点，分别命名为CYP2C19m1和CYP 2C19m2。CYP 2C19m1是第5个外显子上681位碱基G→A发生单碱基突变型引起，使得转录产物mRNA成熟时的剪接位点发生了改变，因而在外显子5前存在40个碱基对的缺乏，此缺乏包含1个SmaI限制性酶切位点。这一变化导致215～227位氨基酸缺乏，并使始于215位氨基酸的阅读框架发生移位，因此，在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生一个终止密码子，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质缺乏血红素的结合区，丧失催化活性。CYP2C19m2是第4个外显子上636位碱基G→A单碱基突变引起，使212位原来编码色氨酸的密码子变为终止密码子，从而只产生CYP2C19前4个外显子的编码产物，仅211个氨基酸组成的没有活性的蛋白质。由此可见，CYP2C19m1和CYP 2C19m2是两个互相独立的突变型等位基因，由于其终产物没有催化活性，因此就失去了对美芬妥英及其他物质的羟化代谢能力。

　　本研究对100例健康对照和50例胃癌患者进行CYP 2C19等位基因分析，结果表明：胃癌组S-美芬妥英慢代谢者的发生率为28.0%，较正常对照组14.0%增加了一倍，两者具有极显著差异(χ²＝4.30，P＜0.05)，说明S-美芬妥英慢代谢者与胃癌的发生具有相关性，PM发生胃癌的相对危险性(OR)＝2.39，95%可信度(CI)：1.04～5.52。从而推测CYP2C19 PM参与了胃癌致癌物的灭活。因此当CYP 2C19酶活性降低时，这些致癌物在体内代谢减慢，从而导致其在体内堆积，增加了致癌物在体内的作用时间和数量，从而增加了胃癌的易感性。

　　肿瘤的发生有两方面的因素：诱因和遗传因素。在相似诱因暴露的情况下，遗传因素在肿瘤的发生方面起着重要的作用。因此，研究基因的多态性有利于早期预防癌症，并对肿瘤的发病机理研究有重要意义。

　　本文课题受浙江省自然科学基金资助(396473)

　　参考文献

　　1，Wedlund PJ,Aslanian wS,McAllister CB,et al.Mephenytoin hydro-xylation deficency in caucasians;Frcquency of a new oxidation drug metabolism.Clin Pharmacol thcr,1984;36(6):773～80

　　2，Wrighton SA,Stevens JC,Becker GW,et al.Isolation and character-zation of human liver cytochrome P450 2C19:Correlation between 2C19 and S-mephenytoin 4' hydroxylation.Archiv of Biochem Biophy,1993;306(1):240～45

　　3，陈枢青，赵鲁杭，孙红颖，等.细胞色素p450 2C19基因多态性及其与肿瘤易患性关系的研究.生命科学探索与进展，1998；111～4

　　4，Chen S,Chou WH,Blouin RA,et al.The cytochrome P450 2D6 enzyme polymorphism;screening costs and influence on clinical outcomes in paychiatry.Clin Pharmacol Ther,1996;60(5):522～34

　　5，de Morsis SMF.Wickinson GR,Blaidell J,et al.The major cnctic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin in human.J Biol chem,1994;269(22):15149～422

　　6，de Morsis SMF,Wickinson GR,Blaidell J,et al.Identification of a new genetic defect responsible for polymorphism of S-mephenytoin metabolism in Japanese.Mol pharmacol，1994;46(4):594～8

　　7，赵筱萍，赵鲁杭，陈枢青.100名健康人群CYP 2C19基因型检测，浙江预防医学，1999；11(10)：17～9

　　8，周有尚，张思维.我国人口死亡和恶性肿瘤死亡分析.中国肿瘤，1997；6(10)：9～11

2000-01-11