幽门螺杆菌和胃癌相关性的研究

　　中国慢性病预防与控制2000年第8卷第3期

　　任刚　蔡嵘　陈强　许幼如

　　摘　要：目的：初步探讨幽门螺杆菌(Hp)感染和胃癌发生的相关性。方法：应用快速尿素酶实验、组织学和分子生物学方法联合检测65例胃粘膜活检标本中Hp感染。结果：胃癌组织中Hp的检出率显著高于正常组，Hp感染与患者年龄、性别无关。结论：Hp可能在从浅表性胃炎→肠化生→不典型增生→胃癌的发生过程中起一定作用。

　　关键词：幽门螺杆菌　胃癌　分子生物学

　　众多研究提示，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与胃癌的发生有密切关系。欧洲胃病研究组织认为约半数胃癌与Hp感染有关，WHO也已正式将Hp列为第一类致病因子。本实验应用快速尿素酶实验、组织学和分子生物学方法对临床上70例胃镜检查的患者进行该菌的检测，以初步了解胃癌患者中Hp的感染率，同时探讨多种方法联合检测的可行性和必要性。

　　1　材料和方法

　　1.1　对象

　　70例1997年1月～11月在本院行胃镜检查患者，事先未接受抗Hp治疗。全部粘膜活检组织均经过病理的证实。其中胃癌30例、浅表性胃炎20例、正常对照胃粘膜20例。

　　1.2　研究方法

　　1.2.1　基因组DNA的抽提　方法参照文献〔1〕。简述如下：新鲜胃粘膜活检标本加入50μl裂解液(50 mM Tris-HCl ［pH7.5］,1 mM EDTA,1% Tween 20 200 μg/ml蛋白酶K)，55℃水浴3小时，再95℃水浴10分钟。

　　1.2.2　PCR-银染方法检测Hp　用于本实验的引物位于Hp16S rRNA基因内，其引物序列为JW21(5’GCGACCTGCTGGAACATTAC 3’)，JW22(5’CGTAGCTGGGCATTACTGGAGA3’)^〔1〕。引物由中科院上海细胞生物学研究所合成。反应体系：总体积100μl，其中Mg²⁺ 1 mM，dNTP各62.5 μM,引物各50 pmol,Taq酶2.5 U，模板10μl。反应条件：95℃ 5分钟，1个循环；95℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃ 10分钟，1个循环PCR。扩增产物上样于8%的PAGE胶，室温下80 v 1.5小时，之后进行银染色。在反应过程中设立阳性对照和阴性对照。

　　1.2.3　快速尿素酶实验检测Hp　购买上海惠泰医疗科技公司试剂盒。活检标本插入凝胶，将试剂板置于室温下，15分钟试剂由蓝变红则检测结束。如不变色或仅粘膜周围略变橙色，将标本保留30分钟后继续观察。

　　1.2.4　甲基蓝染色检测Hp　常规二甲苯脱腊、水化，0.03%甲基蓝水溶液5分钟染色、水化，95%酒精分化脱水，100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.3　统计方法

　　采用卡方检验和四格表确切概率法。

　　2　结果

　　2.1　Hp检测结果的判断

　　Hp阳性标准：PCR(+)加上CLO-test(+)或组织学染色(+)。

　　Hp阴性标准：PCR，CLO-test及组织学方法检测均阴性。

　　2.2　不同组织中Hp检出率

　　结果见表1，胃癌组织中Hp检出率显著高于正常组(P＜0.05)，浅表性胃炎组与正常组差异无显著性(P＞0.05)。

表1　不同组织中Hp检出率

　　注：基本正常胃粘膜是指胃镜下肉眼检查大致正常，病理检查无慢性炎症细胞浸润。★P＜0.05

　　2.3　Hp感染与性别的关系

　　男性患者Hp阳性率为56%(39/70)，女性患者Hp阳性率为44%(31/70)，男性患者Hp阳性率略高于女性患者，但两者相比较无显著性差异(P＞0.05)。

　　2.4　Hp感染与患者年龄的关系

　　将本组患者按年龄分为三组，Ⅰ组为11～40岁，Ⅱ组为41～60岁，Ⅲ组为61～90岁。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组Hp的感染率分别为33%(23/70)，36%(25/70)，31%(22/70)。由此可见，Hp感染在41～60岁组中最高，但三组间比较无显著性差异(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　目前用于幽门螺杆菌感染的实验诊断方法主要有5种：胃镜活检标本染色直接查Hp，Hp的培养法，Hp尿素酶实验，¹⁴C和¹³C尿素呼吸实验，酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清抗Hp igG抗体。近年来，一些新的方法也开始应用于Hp的检测，其中包括限制性内切酶DNA分析法、DNA-RNA杂交法、抗体IgG免疫印迹法^〔2〕、¹⁵N尿素排泄试验^〔3〕、PCR法^〔1〕、PCR-SSCP法^〔4〕、RT-PCR^〔5〕法。每一种诊断方法各有其优缺点，所以不能依靠一种检测方法就来确定Hp感染的诊断，本课题即采用三种方法的联合检测，符合《关于幽门螺杆菌若干问题的意见》所提出的标准^〔6〕。

　　本实验中胃癌患者Hp的感染率为53%，与国外文献报道相符^〔7〕，这可能提示Hp的感染在胃癌的发生某一阶段起一定的协同作用。但其感染率较胃癌前病变为低，这可能是由于病变组织学的改变，原来的环境已不利于Hp的生存，导致Hp死亡或迁移。

　　我们同时研究Hp感染与性别和年龄的关系，我们的结论是它们之间没有相关性。这个结论还有待于更大规模的人群调查和更长时间随访才能作出准确的评价。

　　目前认为Hp是慢性胃炎主要的致病菌。Hp系慢性感染，罕有自发愈合。可以长期存在于胃粘膜中，直到发生萎缩和肠化。Hp感染→慢性胃炎→胃粘膜萎缩→肠腺化生→不典型增生→胃癌这一模式很有说服力，已被部分学者所赞同。本实验也支持这一结论。本课题为卫生部基金(96-2-281)和上海市卫生局基金(964L11)资助项目

　　作者单位：任刚（上海第二医科大学附属新华医院肿瘤中心，上海，200092)

　　蔡嵘（上海第二医科大学附属新华医院肿瘤中心，上海，200092)

　　陈强（上海第二医科大学附属新华医院肿瘤中心，上海，200092)

　　许幼如（上海第二医科大学附属新华医院肿瘤中心，上海，200092）

　　参考文献：

　　〔1〕Judith Weiss,James mecca,Elvira da silva et al.Comparison of PCR and other diagnostic techniques for detecion of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients〔J〕.J clin Microbilol,1994,32(7)∶1663.

　　〔2〕Faulde M,Putzker M,Mertes T,et al.Evaluation of an immunofluorescence assay for specific detection of immunoglobulin G antibodies directed against helicobacter pylori,and antigenic cross-reactivity between H.pylori and campylobacter jejuni〔J〕.J Clin Microbilol,1991,29∶323.

　　〔3〕Wu Ji Cong,Liu Guo Long,Zhang Zhen Hua,et al.¹⁵NH4 excretion test:a new method for detection of Helicobacter pylori infection〔J〕.J Clin microbiol,1992,30(1)∶181.

　　〔4〕王蔚虹，胡伏莲，贾博琦，等.用PCR-SSCP分析区分不同来源的幽门螺杆菌〔J〕.中华消化杂志，1995，15(增刊)∶9.

　　〔5〕Richard M.Peek,JR.,Geraldine G.Miller,Kyit Tham,et al.Detection of helicobacter pylori gene expression in human gastric mucosa〔J〕.J Clin microbiol,1995,33(1)∶28.

　　〔6〕周殿元，张万岱.关于幽门螺杆菌若干问题的意见(草案)〔J〕.中华内科杂志，1997，36(7)∶438.