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抗胃癌单克隆抗体识别的噬菌体呈现肽与天然抗原的关系

抗胃癌单克隆抗体识别的噬菌体呈现肽与天然抗原的关系

细胞与分子免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子免疫学

作者:徐立 金伯泉 樊代明

单位:徐立(第四军医大学西京医院消化病研究所);金伯泉(免疫学教研室,陕西西安710032);樊代明(第四军医大学西京医院消化病研究所)

关键词:胃癌相关抗原;抗原模拟;噬菌体表面呈现;;竞争抑制

  中图号:R392.11R735.2 文献标识码:B

  文章编号:1007-8738(2000)02-0119-02

  噬菌体呈现的随机肽库已成功地用于筛选B细胞或T细胞表位。为进一步研究胃癌相关抗原与相应单克隆抗体(mAb)结合的结构基序及其相互作用,我所通过两株胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库,获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽。我们采用竞争抑制实验,研究了这些肽与天然胃癌相关 抗原的关系。

  1 材料和方法

  1.1 材料 胃癌mAbMG7和MGb2由本所研制[1,2],通过筛选噬菌体呈现的随机九肽库[3,4],获得可与相应mAb结合的噬菌体呈现肽[5,6]

  1.2 方法

  1.2.1 噬菌体呈现肽竞争抑制试验 将纯化的噬菌体分别与相应的mAb4℃孵育过夜。然后在ELISA酶标板中,加入表达胃癌相关抗原MG7和MGb2的KATOIII胃癌细胞(1×104/孔),用丙酮-福

  尔马林固定液固定30s,再加入含50g/LBSA的10mmol/LPBS(pH7.4),37℃封闭2h。每孔中分别加入噬菌体与mAb的混合液100μL,37℃孵育30min,用PBST/PBS洗板。依次加入生物素-抗鼠二抗及亲和素与HRP标记的生物素复合物,常规孵育和洗涤。最后以TMB显色、2mol/LH2SO4终止反应。在酶标仪上读取波长450nm的A值。同时设阴性对照1孔(加入纯化的非重组噬菌体与mAb预孵的混合物),阳性对照1孔(加入细胞与mAb预孵的混合物),及无 竞争抑制1孔(即直接加入抗体)。

抑制率(%)=〔(无竞争抑制孔A450nm值-竞争抑制孔A450nm值)/无竞争抑制孔A450nm值〕×100%

  1.2.2 肿瘤细胞竞争抑制试验 用纯化的mAbMG7和MGb2分别包被聚乙二烯珠子,封闭后加不同稀释度的胃癌细胞KatoIII和阳性噬菌体颗粒,并以空载体作为阴性对照,于37℃孵育2h。以PBST/PBS反复洗涤后,用酸洗脱法回收与mAb结合的噬菌体,感染宿主菌,计算克隆形成数(cfu)。

  2 结果

  噬菌体呈现的抗原模拟肽对天然抗原与胃癌mAb结合的抑制率在50%~80%之间,见表1和图1;天然抗原则可完全抑制模拟肽与胃癌mAb的结合。结果还提示,当模拟肽与各自相应的mAb孵育时,随着细胞密度的增加,与mAb结合的噬菌体数目逐渐减少,见表2和图2;而当呈现肽与非相应mAb孵育时,mAb结合 的噬菌体数目与细胞的密度改变无关。

表1 噬菌体呈现肽ELISA竞争抑制试验A450nm值

mAb 无竞争 阳性 阴性 克隆1 克隆2
MG7 1.397 0.119 1.219 0.483 0.366
MGb2 1.126 0.106 1.008 0.479 0.506

  表2 肿瘤细胞竞争抑制试验的洗脱克隆数

细胞数 空载体 G*-MG7 B*-MGb2 G-MGb2 B-MG7
1×102 63 9.6×104 3.5×104 85 77
1×103 58 3.2×104 8.6×103 102 60
1×104 69 8.0×103 5.2×103 97 66
1×105 64 4.2×103 7.9×102 83 50
1×106 45 96 88 75 54

  *G,B分别代表与mAbMG7和MGb2结合的噬菌体呈现肽.

图1 噬菌体呈现肽竞争抑制试验的抑制率

图2 肿瘤细胞与阳性噬菌体的竞争抑制试验

  3 讨论

  肿瘤相关抗原与正常细胞上抗原分子十分相似,应用mAb技术可区别二者之间的细微差异。那么体现这种差异的分子是什么呢?鉴于肿瘤抗原的研究正由天然蛋白大分子向亚单位、表位多肽过渡[7,8],我们通过用胃癌mAbMG7和MGb2筛选噬菌体呈现的随机九肽库,已获得一些可与mAb结合的噬菌体呈现肽。为进一步明确噬菌体呈现肽与细胞表达的天然胃癌抗原间的关系,我们采用竞争抑制实验进行了探讨。结果提示,噬菌体呈现肽与mAb的结合位点,位于细胞表面天然抗原与mAb结合位点之中,而且两株mAb识别的表位之间无交叉反应。

  基金项目:国家杰出青年基金,No.39525020

  作者简介:徐立,女,30岁,博士生,西安市长乐西路15号,Tel.(029)3375227

  参考文献:

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收稿日期:1999-05-28

  修回日期:1999-08-23


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