小鼠肝癌H₂₂细胞LDL受体活性的研究

肿瘤防治杂志 2000年第2期第17卷 基础与临床研究

作者：毕文祥　肖广全　张培海　孔峰　徐松德

单位：毕文祥　孔峰　徐松德(山东医科大学生化教研室　济南市 250012)；肖广全(山东省煤炭卫校枣庄市　277011)；张培海(山东医科大学附院妇产科　济南市　250012)

关键词：肝肿瘤/小鼠；肝肿瘤/H22细胞；受体/LDL

　　【摘要】目的：观察小鼠肝癌H₂₂细胞LDLR活性。方法：对小鼠肝癌H₂₂细胞和正常肝细胞进行受体结合的Scatchard分析和单点分析。结果：①H₂₂细胞对LDL的亲和性与正常肝细胞相同，但H₂₂细胞Bmax明显增多；②H₂₂细胞对LDL的非特异性结合、内移和降解能力与正常肝细胞相同。结论：小鼠肝癌H₂₂细胞LDLR活性增高，其对LDL的内移和降解功能未变。

　　中图分类号：R73-36⁺2；Q95-334　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571(2000)02-0118-02

The study of activity of LDL receptor in murine hepatoma H₂₂ cells

BI Wen-Xiang,XIAO Guang-quan,ZHANG Pei-hai,et al.

　　(Department of Biochemistry,Shandong Medical University,Jinan 250012)

　　【Abstract】Objective：To investigate LDL receptor activity in murine hepatoma H₂₂ cells.Methods：The scatchard and single point analysis of LDL receptor in murine H₂₂cells and normal hepatic cells were performed.Results：(1)LDLR affinity and specifity binding LDL were similar in murine H₂₂ cells and normal hepatic cells,but the maximum binding of LDL in murine H₂₂ cells was obviously higher than those in normal hepatic cells;(2)In murine H₂₂ cells and normal hepatic cells,the non-specific binding values were not significantly different,and the ability to internalize and degrade LDL was the same.Conclusions：Murine H₂₂ cells have elevated LDLR activity,the ability to internalize and degrade LDL in H₂₂ cells is not changed.

　　【Key words】liver neoplasms;H₂₂ cells;mice;receptors/LDL

　　很多癌瘤细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)活性显著增高，低密度脂蛋白(LDL)代谢明显增强^［1］。我们用受体结合的Scatchard分析和单点分析观察了小鼠肝癌H₂₂细胞LDLR对LDL的结合、内移和降解。

　　1　材料与方法

　　1.1　LDL及去脂蛋白血清(LPDS)的制备

　　取正常人空腹血清，用序列超速离心法^［2］分离LDL (d:1.019～1.063 kg/L)及LPDS(d＞1.21 kg/L)(Beckman L 8～55 M超速离心机)，所得LDL及LPDS在4℃用缓冲液(Na₂HPO₄，50 mmol/L，NaCl 100 mmol/L,Na₂EDTA 0.27 mmol/L，pH 7.4)透析48 h，用聚乙二醇浓缩，经0.22 μm滤膜除菌、分装，置4℃冰箱备用。LDL经琼脂糖电泳鉴定为1条带。蛋白质定量采用Lowry法。

　　1.2　¹²⁵I-LDL的制备

　　参照Iodogen法^［3］，用Na¹²⁵I(无载体，无还原剂，由中国原子能研究院提供)标记LDL。碘标记率为86.7%，比放射性为163～405/(min·ng) LDL protein。其中脂质标记率＜5%，游离碘＜2%。琼脂糖电泳鉴定为一条带。免疫扩散表明¹²⁵I-LDL与LDL具有相同生物活性。

　　1.3　细胞培养

　　取H₂₂细胞(由山东省医学科学院药物研究所提供)及正常肝细胞(经原代培养获得)，按5×10⁴细胞/孔接种于12孔培养板，培养于CO₂湿度培养箱(5%CO₂，37℃)。培养液采用含10%小牛血清的RPMI 1640。2天后用PBS洗1次，加含10%LPDS(5 g/L)的RPMI 1640培养液预培养48 h。预培养前后用台酚蓝拒染法常规检测细胞活力，均大于95%。

　　1.4　细胞受体实验

　　1.4.1　受体结合Scatchard分析^［4］两细胞组每孔待测细胞培养液中分别加入¹²⁵I-LDL，使其最终浓度分别为5、10、20、40、60 mg/L(每个浓度均为双份)，37℃培养2 h，冰浴5 min以终止其内移作用。移除全部培养液。移除培养液的细胞经充分洗涤后加入2.0 ml含肝素钠(5 g/L)及10%小牛血清的PRMI 1640培养液，4℃放置1 h后移出全部培养液并测其放射性计数，放射性计数为细胞对¹²⁵I-LDL的总结合量。细胞对¹²⁵I-LDL的非特异性结合采用同时加入过量(50倍)未标记LDL的方法获得，总结合量减去非特异性结合量即为特异性结合量。

　　1.4.2　受体单点分析　细胞预培养同前。于培养液中分别加入¹²⁵I-LDL，使其最终浓度为20 mg/L。按上述步骤测两种细胞对¹²⁵I-LDL的结合。内移用肝素钠处理过的细胞经充分洗涤后，用2 ml 0.1 mol/L NaOH溶解细胞，然后测放射性计数及细胞蛋白含量。降解终止反应后移出的培养液，加入0.5 ml 3 mol/L三氯醋酸，4℃放置30 min，离心弃沉淀，于上清中加入10 μl 2.2 mol/L KI及40 μl H₂O₂(30%)，室温放置5 min，加2 ml氯仿，振荡、离心、测水相部分放射性计数，即为被细胞降解的¹²⁵I-LDL量。

　　1.5　统计学处理

　　采用t检验法。

　　2　结果

　　2.1　受体结合Scatchard分析

　　H₂₂细胞和正常肝细胞的Kd值相似，H₂₂细胞对LDL的最大结合值Bmax为正常肝细胞的1.78倍。表明H₂₂细胞及正常肝细胞LDLR对LDL的亲和性和特异性相同，H₂₂细胞结合LDL量较正常肝细胞明显增多(表1、表2)。

表1　正常肝细胞和H₂₂细胞Bound/Free(10^-3)值

表2　H₂₂细胞及正常肝细胞的Kd值和Bmax值

　　2.2　受体单点分析

　　①与正常肝细胞相比，H₂₂细胞对¹²⁵I-LDL的结合、内移及降解量均显著增加；②H₂₂细胞与正常肝细胞对¹²⁵I-LDL非特异性结合量无显著差异；③H₂₂细胞¹²⁵I-LDL的内移/结合及降解/内移比值分别为1.6和5.8，与正常肝细胞1.7与6.2相似，提示H₂₂细胞和正常肝细胞对LDL的内移及其溶酶体对LDL的降解力相同(表3)。

表3　受体单点分析结果(±s)〔n=4，m/(μg·g)〕

　　3　讨论

　　用多种方法可把亲脂的抗癌药物掺入到LDL中而制备成LDL-药物复合物^［5.6］。此类复合物在LDLR介导下可定向浓集于LDL代谢活跃的癌瘤细胞，从而选择性地杀伤癌瘤细胞。本实验显示，H₂₂细胞对LDL的亲和性和特异性与正常肝细胞相同，与正常肝细胞相比，LDLR活性明显增高。因此，H₂₂细胞株可用于研究LDL-药物复合物的靶向抗肿瘤作用。用H₂₂细胞进行研究的优点在于该细胞不但可以细胞水平进行观察，而且也可用来建立成本低、重复性好的LDLR高表达的动物肿瘤模型，从而可以很方便地对LDL-药物复合物靶向抗肿瘤作用进行动物实验方面的研究。

　　山东省科委科研基金资助项目(971164607)

　　参考文献：

　　［1］Rudling MJ,Angelin B, Peterson CO,et al.LDLR activity in human intracranial tumors and its relation to the cholesterol requirement［J］.Cancer Res,1990,50:483-487.

　　［2］蔡海江，范乐明，杨绍紊，等.人血清脂蛋白的序列超速离心［J］.南京医学院学报，1983，1：42-44.

　　［3］王世真，林汉，周前，等.核医学与核生物学基础及应用［M］.北京：科学出版社，1990，359-362.

　　［4］Goldstein JL and Brown MS Binding and degradation of LDL by cultured human fibroblasts［J］.J Biol Chem，1974，249(16)：5153-5162.

　　［5］Iwanik MJ,Shaw KV,Ledwith BJ,et al.Preparation and interaction of a low density lipoprotein:daunomycin complexs with P388 leukemic cells［J］.Cancer Res,1984，44：1206-1215.

　　［6］Lestavel-Delatlre S,Martin-Nizard F,Clavey V,et al. Low density lipoprotein for delivery of an acrylophenone antineoplastic molecule into malignant cells ［J］.Cancer Res,1992，52：3629-3635.

收稿日期：1999-09-19

修回日期：1999-10-17