六磷酸肌醇对人肝癌7402细胞凋亡的诱导

肿瘤 2000年第6期第20卷 短篇报道

作者：杜鹃　张振书　张亚历　周殿元　孔祥建

单位：孔祥建　杜鹃（山东兖州矿业集团有限责任公司总医院消化内科　邹城 273500）；张振书　张亚历　周殿元（广州第一军医大学南方医院全军消化内科研究所）

关键词：植酸；肿瘤细胞，培养的；细胞凋亡

　　中图分类号：R73-36　　文献标识码：B

　　文章编号：1000-7431(2000)06-0447-01

　　六磷酸肌醇(IP₆)是高纤维食物的有效成分。流行病学调查表明，富含IP₆的谷、豆类饮食与结肠癌、乳腺癌的发生呈负相关：研究还发现，IP₆能抑制肝、肺、前列腺和其它脏器肿瘤的发生、发展和转移^［1］。IP₆的抗癌作用已在体内外实验中得到证实^［2～4］。作者新近研究发现，体外IP₆亦能诱导人肝癌7402细胞凋亡。

　　材料与方法

　　一、细胞系及细胞培养　肝癌细胞系7402由我所冻存。培养基为RPMI-1640，含浓度为10%小牛血清(CS杭州四季青)、青链霉素终浓度各100 U/ml，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中单层贴壁生长。

　　二、细胞凋亡的诱导　肝癌7402细胞用含0.02% EDTA，0.25%胰蛋白酶(Serva)消化传代至50 ml培养瓶，细胞数为5×10⁵待生长至对数生长期时分两组。处理组，在含有10% CS的RPEM-1640培养液中加入1 mmol/L IP₆(Sigma)，动态观察细胞生长情况。阴性对照组，在培养瓶中加入与同浓度IP₆等体积的双蒸水；阳性对照组，取昆明小鼠1只取胸腺，制成细胞悬液，RPMI-1640培养液中加地塞米松，培养6 h后收集细胞。

　　三、流式细胞仪检测肝癌7402细胞的凋亡　在流式细胞仪(FACS-420，美国Becton Dickinson Co)上根据细胞FL2荧光分布直方图，判断细胞凋亡。

　　四、细胞DNA的提取　离心，弃上清，加入细胞裂解液、蛋白酶K，37 ℃温育12 h，加入等体积的酚，氯仿；异戊醇(24∶1)各抽提1次，上清加两倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠，混匀，置液氮中10 min，12000 r/min 10 min离心沉淀DNA，真空抽干，加TE 100 μl，RNase 5 μl，37 ℃水浴30 min，1 %琼脂糖凝胶电泳。

　　五、透射电镜观察凋亡细胞形态　收集细胞于5 ml无菌离心管中，PBS洗1次，转移至含2 %琼脂的制备电镜标本的模具中，弃PBS，加入2%戊二醛作前固定。

　　结　　果

　　一、透射电镜形态学观察　可见典型的凋亡细胞形态。

　　二、琼脂糖凝胶电泳检测DNA裂解片段　提取DNA，分别做琼脂糖凝胶电泳可见典型的梯状带，阴性对照组呈基因组带。

　　三、流式细胞仪DNA倍体分析　7402细胞经IP₆处理6 h后，G₁前出现一亚二倍体峰，凋亡率为18.4 %，并随处理时间的延长凋亡率逐渐升高，12 h，24 h凋亡率分别为33.1%、40.2%。与DNA电泳结果相符。

　　讨　　论

　　六磷酸肌醇IP₆的抗癌机理尚不完全明确。同位素示踪研究表明，IP₆能作用于细胞膜上的酪氨酸激酶受体和磷脂酶C受体、竞争结合胰岛素样生长因子Ⅱ受体的限制性位点控制细胞增殖的速度。另外，IP₆被细胞吸收后能很快进入细胞内磷酸肌醇池，向Ins、IP_1-5转化发挥抗癌作用。Khan等证实Ⅲ型IP₃能介导Ca²⁺进入淋巴细胞与其凋亡有关。IP₆是否是通过控制内质网膜Ca²⁺通道释放Ca²⁺而诱导肿瘤细胞凋亡，尚有待进一步研究证实。

　　杜鹃，女，硕士，住院医师(收稿日期：2000-01-18)