血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9在原发性肝癌中的表达及其临床意义
癌症 2000年第1期第19卷 基础研究
作者：蒋扬富 杨治华 胡敬群 蔡建强 杨晓洁
单位：蒋扬富 杨治华 胡敬群 蔡建强 杨晓洁（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所，北京100021）
关键词：肝肿瘤；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶
摘要：目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）与基质金属蛋白酶9（MMP-9）在原发性肝癌中的表达与肝癌复发、转移的关系。方法：采用逆转录聚合酶链式反应技术，对39例原发性肝癌的手术切除标本（包括癌组织及癌旁肝组织）中的VEGF及MMP-9基因表达进行了检测。结果：VEGF分别在92％（36/39）的肝癌组织、79％（26/33）的肝硬变组织和57.1％（4/7）的正常肝组织中表达，MMP-9分别在69％（27/39）的肝癌组织和35.9％（14/39）的肝硬变组织中表达。39例患者中已有16例转移、复发，MMP-9基因表达与肝癌复发、转移关系密切，复发、转移组癌组织MMP-9/β2-MG值为0.75±0.56,未复发、转移组癌组织MMP-9/β2-MG值为0.34±0.29(P＜0.05)。 VEGF基因表达与肝癌复发、转移尚未见显著相关性，复发、转移组与未复发、转移组癌组织MMP-9/β2-MG值分别为1.08±0.68和 0.92±0.63(P＞0.05)。结论：VEGF及MMP-9基因在肝癌及肝硬变组织中均有差异性表达，VEGF与肝癌生长关系密切；MMP-9基因表达与肝癌侵袭、转移有关，可作为反映肝癌复发、转移潜能的生物学指标。
分类号：R735.7 文献标识码：A
文章编号：1000－467X(2000)01－0017－03
Expression of vascular endothelial growth factor and
matrix metalloproteinase-9 in hepatocellular carcinoma
JIANG Yang-fu, YANG Zhi-hua, HU Jing-qun, et al.
Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021,P.R. China
Abstract：Objective：To investigate the relationship between the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and recurrence or metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC).Methods：VEGF and MMP-9 gene expression in 39 pairs of HCC tissues and nontumorous liver tissues with or without liver cirrhosis were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) .Results：VEGF messenger RNA (mRNA) expression was present in 36 of 39 (92％ ) resected HCCs, the degree of VEGF expression in 23 HCCs was higher than that in corresponding nontumorous liver tissues. MMP-9 mRNA expression was found in 27 of 39 (69％ ) cases, and 18 of 27 these samples showed stronger expression in the tumorous tissues than that in the nontumorous tissues. The level of MMP-9 expression correlated significantly with intra-or extra-hepatic metastasis, and the patients with high degree of MMP-9 mRNA expression in HCC were more susceptible to postoperative recurrence or metastasis. Conclusions： Expression of MMP-9 correlates closely with the recurrence or metastasis of HCC. High level of both VEGF and MMP-9 expression is a predictor for poor prognosis of HCC.
Key words：Hepatocellular carcinoma; Vascular endothelial growth factor; Matrix metalloproteinase ▲
肿瘤血管形成与肿瘤生长密切相关，而肿瘤血管形成与多种细胞因子的作用有关，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前所知的作用最强的一种促血管生长因子。基质金属蛋白酶是一种与肿瘤转移密切相关的物质，近来发现它也与肿瘤血管形成有关。本研究同时检测VEGF和基质金属蛋白酶9（MMP-9）基因在肝癌及肝硬变或正常肝组织中的表达，前瞻性地研究它们与肝癌复发、转移等生物学行为的关系。
1材料和方法
1.1病例和组织标本
共收集39例手术切除的肝癌及肝硬变或正常肝组织。男性患者32例，女性7例。年龄35～71岁（中位年龄54岁）。合并肝硬化者占82％（32/39）。TNM分期：Ⅱ期26例，Ⅲ期13例。19例肿瘤直径小于5cm，20例肿瘤直径大于5cm。术后均经病理证实为肝细胞肝癌，高分化5例，中分化16例，低分化12例，分化程度不明确6例。16例在术后最长随访时间20个月内复发、转移。
1.2逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）
采用TRIzol(GibcoBRL公司)试剂提取组织总RNA，然后逆转录为cDNA，30μl反应体积中含5倍第一链缓冲液6μl，dGTP、dATP、dTTP、dCTP各0.5mmol/L,10mmol/LDTT,10μg/mloligo(dT)1218,24URNAsin,200μmol/LMMLV(GibcoBRL公司)逆转录酶，6μg总RNA，37℃反应1小时，95℃5分钟终止反应。25μlPCR反应体系中含dGTP、dATP、dTTP、dCTP各200mmol/L，1.5mmol/LMgCl2,2.5μl10倍缓冲液，正、反义引物(由生工公司合成)各15pmol,1.5μl逆转录产物，Taq酶1单位。反应条件为：94℃预变性2min,92℃30s,62℃30s,72℃1min,30循环后于72℃延伸5min。
PCR所用的引物序列如下：
| 靶基因 |
正义引物 |
反义引物 |
| VEGF |
5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′ |
5′-AATGCTTTCTCCGCTCTG-3′ |
| MMP-9 |
5′-CGGAGCAGGAGACGGGTAT-3′ |
5′-TGAAGGGGAAGACGCACAGC-3′ |
| β2-MG |
5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3′ |
5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′ |
VEGF引物可扩增出165及189两种剪接变异体，扩增产物大小分别为417及490bp，MMP-9扩增产物长537bp,β2-MG扩增产物长121bp。
1.3PCR产物的相对定量
PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，然后行光密度扫描，以VEGF或MMP-9的光密度值与内参照β2-MG的光密度值之比值作为相互间比较的参数。
1.4统计分析
计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验。
2结果
2.1VEGF基因在肝癌及肝硬变或正常肝组织中的表达
39例肝癌组织中有36例（92％）扩增出VEGFcDNA即VEGF表达阳性，33例肝硬变组织中26例VEGF表达(79％)，7例正常肝组织4例VEGF表达（57.1％）。36例VEGF表达阳性的肝癌组织中23例（63.9％）VEGF表达水平高于癌旁组织（图1），癌组织与癌旁组织的VEGF/β2-MG值分别为1.57±0.95和0.62±0.56。
图1VEGF的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳
M：PGEM7ZF/HaeⅢ分子量参照物T：癌组织N：癌旁肝组织
2.2MMP-9基因在肝癌及肝硬变或正常肝组织中的表达
39例肝癌组织中27例（69％）MMP-9mRNA表达阳性，肝硬变组织中MMP-9基因表达阳性率为40.6％（13/32），7例正常肝组织中1例MMP-9表达阳性。12例仅在癌组织中表达而肝硬变组织无表达;13例在癌及肝硬变组织中均有表达，这13例中6例癌组织MMP-9表达水平高于肝硬变组织，癌组织和癌旁肝组织的MMP-9/β2-MG比值分别为1.1±0.48和0.35±0.20。因此，39例肝癌组织中共有18例MMP-9表达水平明显高于癌旁肝组织。12例癌与肝硬变组织均无MMP-9mRNA表达。39例癌组织MMP-9/β2-MG比值为0.57±0.56，39例癌旁肝组织MMP-9/β2-MG比值为0.25±0.45,两者有显著性差异（P＜0.05）。MMP-9与VEGFmRNA在肝癌中表达的相互关系见表1。
表1 VEGF与MMP-9mRNA在肝癌组织中的表达
| VEGF表达 |
n |
MMP－9表达 |
| 阳性 |
阴性 |
| 阳性 |
36 |
25 |
11 |
| 阴性 |
3 |
2 |
1 |
2.3VEGF及MMP-9mRNA表达与临床病理特征的关系
VEGF及MMP-9mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期等均无显著相关性（P＞0.05）。16例已经复发、转移的患者癌组织MMP-9/β2-MG比值平均为0.75±0.56，23例尚未复发、转移的患者癌组织MMP-9/β2-MG比值平均为0.34±0.29,两者有显著性差异(P＜0.05）。15例癌组织MMP-9/β2-MG比值大于0.34及18例癌组织MMP-9表达水平高于癌旁肝组织2倍以上的患者中分别有11例和13例发生肿瘤复发、转移，23例癌组织MMP-9/β2-MG比值小于0.34及21例癌组织MMP-9表达水平近似于或低于癌旁肝组织的患者中分别有5例和3例发生肿瘤复发、转移，MMP-9表达水平与肝癌复发、转移密切相关。16例肿瘤复发、转移的患者癌组织VEGF/β2-MG比值平均为1.08±0.68,23例尚未复发、转移的患者癌组织VEGF/β2-MG比值平均为0.92±0.63,两者无显著性差异（P＞0.05）；20例癌组织VEGF/β2-MG比值大于1及23例癌组织VEGF表达水平高于癌旁肝组织2倍以上的患者中分别有7例和10例发生肿瘤复发、转移，19例癌组织VEGF/β2-MG比值小于1及16例癌组织MMP-9表达水平近似于或低于癌旁肝组织的患者中分别有9例和6例发生肿瘤复发、转移（见表2）。根据目前的资料，VEGF表达水平与肝癌复发、转移无显著相关性。这些病例仍在继续随访之中。此外，11例VEGF与MMP-9表达水平均上调（T＞N）的患者中已有9例复发、转移，而7例VEGF与MMP-9表达水平均下调的患者中1例复发、转移，提示MMP-9与VEGF联合检测将更有助于肝癌预后的判断。
表2VEGF及MMP-9表达与临床病理特征的关系
| 因素 |
n |
VEGF |
MMP-9 |
P值 |
| T＞N |
T＞N |
| 肿瘤大小 |
|
| ≤5cm |
19 |
12 |
8 |
＞0.05 |
| ＞5cm |
20 |
11 |
10 |
| 分化程度 |
|
| 高分化 |
5 |
1 |
1 |
＞0.05 |
| 中分化 |
16 |
11 |
9 |
| 低分化 |
12 |
9 |
6 |
| 不确定 |
6 |
2 |
2 |
| 临床分期 |
|
| Ⅱ期 |
26 |
16 |
10 |
＞0.05 |
| Ⅲ期 |
13 |
7 |
8 |
| 复发、转移 |
|
| 已发生 |
16 |
10▲ |
13△ |
|
| 末发生 |
23 |
13 |
5 |
|
注：▲指P＞0.05，△指P＜0.05，与未发生复发、转移组比较3讨论
肝癌术后或介入治疗后的复发、转移率较高，因此很有必要研究与肝癌生长、侵袭和转移有关的因素，寻找更有效的预测肝癌复发、转移潜能的生物学指标。肿瘤血管既是肿瘤生长的基础，又是转移的重要途径[1]。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是促进血管生长的重要因子，它有四种剪接变异体即VEGF121、165、189、206，分别含121、165、189及206个氨基酸[2]。本研究结果表明VEGF在肝癌组织中的阳性表达率为92％，肝硬变组织中的表达率为79％，正常肝组织的表达率为57％，均以VEGF165表达为主。就同一患者的肝癌组织与肝硬变组织VEGF的表达水平而言,69.4％的肝癌组织VEGF表达水平高于癌旁组织，54％（21/39）的肝癌组织VEGF高表达，而癌旁组织VEGF高表达者仅占8％（3/39）。由此可见，在由肝硬变发展为肝癌的过程中，VEGF的表达水平呈上调趋势。此外，我们采用具有中和活性的VEGF抗体治疗人肝癌BEL7402裸小鼠移植瘤，结果也表明VEGF抗体可抑制肿瘤生长。以上结果表明VEGF与肝癌生长、演进关系密切，是一个治疗肝癌的靶点。根据目前的临床资料，复发、转移组与尚未复发、转移组VEGF表达尚未见显著差异，因此，VEGF能否作为独立的肝癌预后指标，尚有待根据进一步的随访资料判定。
研究表明，细胞外基质也与肿瘤血管生长有关，并与肿瘤转移关系密切。新生血管的形成不仅需要血管基底膜的降解，而且需要降解细胞外基质蛋白[3]。MMP能够降解基底膜糖蛋白及细胞外基质成分，因此MMP可促进肿瘤血管生长[4]。本研究结果表明MMP-9基因不仅在肝癌与肝硬变组织中有差异性表达并且与肝癌复发、转移关系密切，MMP-9高表达者复发、转移率较高，预后不良。正是因为MMP-9还能降解细胞外基质，因此，MMP-9高表达的肿瘤细胞在侵袭、转移过程中突破各种屏障如基底膜的能力也较高，这样的肿瘤细胞易于发生转移。本研究结果证实MMP-9可作为一种独立的预测肝癌复发、转移的生物学指标,MMP-9基因表达水平较高的肝癌预后差。此外，实验结果还表明，MMP-9与VEGF表达水平均上调的肝癌患者复发、转移潜能很大，而MMP-9与VEGF表达水平均不高的肝癌患者复发、转移潜能较小，因此，若将VEGF与MMP-9的检测结合起来分析，则更将有助于肝癌预后的判断。
*通讯作者：Tel：86－10－67781331－8439
Fax：86－10－67709001
Email：zhyang@public.bta.ent.cn
参考文献：
［1］Blood CH, Zetter BR. Tumor interactions with the vasculature： angiogenesis and tumor metastasis［J］. Biochim Biophys Acta, 1990, 1032： 89～ 118.
［2］Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing［J］. Biol Chem, 1991, 266： 11947～ 11954.
［3］Chambers AF, Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis［J］. Natl Cancer Inst, 1997, 89： 1260～ 1270.
［4］Sato H, Kida Y, Mai M, et al. Expression of genes encoding type Ⅳ collagen-degrading metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in various human tumor cells［J］. Oncogene, 1992, 7： 77～ 83.
收稿日期：1999－01－21
修回日期：1999－04－29
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