半乳糖脂修饰的阿霉素脂质体体外杀伤肝癌细胞的实验研究
癌症 1999年第3期第18卷 基础研究
作者：常桂民 段芳龄 张向东 杨淑英 盛剑秋
单位：常桂民（北京医科大学第三医院消化科 北京，100083）；段芳龄 杨淑英 盛剑秋（河南医科大学消化疾病研究所）；张向东（河南信阳卫校附院）
关键词：肝细胞癌；脂质体；糖脂；阿霉素
【摘要】目的：合成n－十六烷酰－1－硫代－β－D－半乳糖苷（Cetyl－Gal），并用其修饰阿霉素脂质体表面，观察体外对人肝癌细胞系SMMC-7721的杀伤作用。方法：半乳糖经化学反应制备Cetyl-Gal，用10％摩尔的糖脂整合到超声法制备的小单层阿霉素脂质体脂膜上进行体外杀瘤研究，MTT法检测杀瘤活性。结果：48小时细胞毒试验糖脂阿霉素脂质体对人肝癌细胞系SMMC7721的杀伤作用优于无糖脂阿霉素脂质体（P＜0.05），而对非靶细胞（B16黑色素瘤细胞）的杀伤作用糖脂和无糖脂阿霉素脂质体两者相近。0.5h预处理实验表明：缩短药物与细胞接触时间后，糖脂阿霉素脂质体仍保持较强的杀伤肝癌细胞作用。结论：半乳糖阿霉素脂质体对人肝癌细胞杀伤作用较无糖脂组及非靶细胞组为强。
中图号：R735.7；R979.1 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(1999)03－0281－04
Experimental study on antitumor activity of neo－galactolipid modified
adriamycin liposome on liver cancer cells SMMC－7721
CHANG Gui－min, DUAN fang－ling, ZHANG xiang－dong,et al.
Digestive Disease research Center,The Third Hospital of Beijing Medical University,
beijing 100083,China
【Abstract】Objective：To study the antitumor activity of neo－galactolipid－modified adriamycin(ADM) liposomes on SMMC－7721 in vitro.Method：n－Cetyl－1－thio－β－D－galactoside(Cetyl－gal) was synthesized by a series of reaction from galactose and incorporated into small Unilamellar Vesicles(SUV) which was prepared by sonication at the ratio of l－α－PC：Chol：L－α－PE(7∶2∶1 molar ratio) with or without 10 mol％ Cetyl－gal. cytotoxicity assay on SMMC－7721 in vitro was performed.Results：Results of 48h cytotoxicity assay with MTT method showed that specific cytotoxicity of galactolipid groups to SMMC－7721 were 24 fold more effective than the control non－galacto－lipid group, but with very similar cytotoxicity to non－targeted b16 melanoma cells.0.5h pretreatment assay demonstrated that cytotoxicity of free ADM on SMMC－7721 decreased remarkably(IC50=78.9μ mol/L),but galactolipid ADM liposomes remain higher activity(IC50=6.88μ mol/L) than control non－galactp－lipid group (IC50＞100μ mol/L) after reducing the contact time(to 0.5h) between drugs and cells.Conclusions：Results indicated that cytotoxicity of galactolipid－modified aDM liposome on SMMC－7721 was higher than on nontargeted cell B16 melanoma and higher than non－galactolipid modified ADM liposome and free ADM group were observed.
Key words：Hepatocellular carcinoma; Liposome;Glucolipids;Adriamycin
药物的导向治疗是增强药物的特异性、提高疗效、减少对其它组织器官损伤的重要措施[1]。脂质体（liposome）是一种良好的药物载体，具有缓释作用、降低药物毒性、保护药物免受酶的降解等特点。未经修饰的脂质体大多数被网状内皮系统摄取〔2〕。为了进行导向治疗常用配体修饰脂质体表面，通过受体配体介导的内吞作用导向药物至靶位点。哺乳动物肝实质细胞膜上存在一类受体，该受体能专一识别以非还原半乳糖或N乙酰半乳糖为末端的糖蛋白或糖脂〔3〕。肝细胞癌是一种癌变的肝实质细胞，其细胞膜上仍具有这种肝半乳糖受体。为了研究肝半乳糖受体介导的药物靶向作用，本研究合成了n－十六烷酰-1-硫代-β-D-半乳糖苷，并用其修饰脂质体表面，观察半乳糖阿霉素脂质体体外对人肝癌细胞系的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
主要试剂：D－半乳糖（分析纯），L－α－磷脂酰胆碱（L－α－PC）、L－α－磷脂酰乙醇胺（L－α－PE）、胆固醇（Chol）均为日本和光株式会社产品，MTT（华美公司），RPMI－1640（美国Gibco公司），小牛血清（军事医学科学院），其余均为分析纯。
1.2 方法
1.2. 1n－十六烷酰-1-硫代-β-D-半乳糖苷的合成：半乳糖经过乙酰化、溴化、缩合、亲核取代反应制备n－十六烷酰-1-硫代-β-D-半乳糖苷。透析后冰冻干燥，放入低温冰箱保存备用。所有终产物均经过1H－NMR、13C－NMR、薄层层析检测，结果与文献报道一致〔4〕。
1.2.2 脂质体的制备及其特性〔5〕：无糖脂组脂质体由L－α－PC∶Chol∶L－α－PE（7∶2∶1摩尔比）组成；半乳糖组外加10％mol的n－十六烷酰-1-硫代-β-D-半乳糖苷，总脂量为10μmol。脂质体的制备方法根据文献〔5〕进行。最后将制得的小单层脂质体小泡滴于Formwan膜铜网上，2％磷钨酸负染2～5分钟，观察其形态、大小、结构并测脂质体直径。无糖脂组脂质体和半乳糖组脂质体直径分别为54±30nm（糖脂组，n=4）和52±28nm（对照组，n=4）。阿霉素脂质体的纯化和包封率测定根据文献〔6〕进行，结果阿霉素的包封率为10.30％±1.2％（n=4）。
1.2.3 半乳糖脂阿霉素脂质体体外细胞毒试验（MTT法）〔7〕：48小时毒性试验。细胞系：SMMC－7721，人肝癌细胞系(由中国科学院上海细胞生物研究所提供)；小鼠B16黑色素细胞系(由河南省医学科学研究所提供)。细胞培养在RPMI－1640加10％小牛血清、青霉素、链霉素中维持生长。培养条件：37℃、5％CO2的潮湿环境。细胞毒检测在对数生长期进行，取人肝癌细胞系SMMC7721稀释成1×104/ml，加在96孔培养板上，每孔0.1ml，分别加入糖脂阿霉素脂质体、无糖脂阿霉素脂质体、游离阿霉素溶液、及1640液(空白对照组）共4组，阿霉素浓度每组设5个，分别为0.01，0.1，1，10，100μmol/L，培养48h后MTT法测定杀伤率，测定波长为570nm。同法用B16黑色素瘤细胞重复上述实验。
0.5h预处理细胞毒实验：同上加入药物后孵育0.5h（代替48h），用1640液洗去药物后继续培养48h，用MTT法测量计算杀伤率。
杀伤率=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100％
2 结果
糖脂阿霉素脂质体、游离阿霉素溶液、无糖脂阿霉素脂质体对肝癌细胞系SMMC7721和B16黑色素瘤细胞系的48h、0.5h杀瘤活性（IC50表示）见表1。
表1 3个实验组对肝癌细胞系SMMC7721和B16黑色素瘤细胞系48h、0.5h的IC50（μmol/L)
| 组别 |
人肝癌SMMC－7720IC50 |
B16黑色素瘤 |
| 48h |
0.5h |
48h |
0.5h |
| 半乳糖脂组 |
0.13 |
6.88 |
4.63 |
＞100 |
| 无糖脂组 |
3.12 |
＞100 |
3.15 |
＞100 |
| 游离阿霉素组 |
0.21 |
78.9 |
0.74 |
60.5 |
图1 48h细胞毒检测(MTT)法：A.SMMC7721；B.B16黑色素瘤。
48h细胞毒试验（图1A、B）表明糖脂阿霉素脂质体对靶细胞SMMC－7721的杀伤作用与游离阿霉素相似（P＞0.05），优于无糖脂非特异阿霉素脂质体（P＜0.05，IC50分别为0.13μmol/L、3.12μmol/L），但对非靶细胞B16作用较小（IC50="4.63"μmol/L），如以IC50计，则糖脂阿霉素脂质体对肝癌细胞的杀伤作用是无糖脂阿霉素脂质体的24倍，而对B16黑色素瘤细胞系的毒性仅为游离阿霉素的0.17倍，这表明糖脂脂质体的选择性杀伤作用可能来自半乳糖受体的介导。阿霉素的体内半寿期为20min，所以，为了接近体内条件，减少药物的非特异性摄取，进行了0.5h处理细胞毒试验（图2A、B），结果表明缩短药物接触时间后，游离阿霉素对靶细胞的杀伤作用明显减弱（IC50="78.9"μmol/L），而糖脂阿霉素脂质体对靶细胞仍保持较强的杀伤能力（IC50="6.88"μmol/L），在10μmol/L浓度时，糖脂阿霉素脂质体对靶细胞的杀伤率为63.5％，游离阿霉素和无糖脂阿霉素脂质体分别为39.5％和15.7％，而对非靶细胞的杀伤率三者分别为18.7％，38.9％，14.6％，以IC50计接触0.5h糖脂阿霉素脂质体对肝癌细胞的杀伤作用是无糖脂阿霉素脂质体的15倍以上。
图2 0.5h预处细胞毒检测(MTT法)：A.SMMC7721；B.B16黑色素瘤。
3 讨论 脂质体具有类似生物膜的脂质双层结构，脂质双层上可以嵌入和膜蛋白或膜脂类似的生物大分子如配体（ligand），因为细胞表面常具有某些生物大分子的特异受体（receptor），因而嵌入配体的脂质体能与具有特异受体的细胞结合，这种作用称为寻靶〔8〕，这可将脂质体内包裹的药物释放至靶细胞内。
半乳糖脂阿霉素脂质体体外杀瘤作用特点：
(1)减少用药剂量，尤其适合体内应用：48h细胞毒结果表明半乳糖阿霉素脂质体对人肝癌细胞系的杀伤作用优于无糖脂阿霉素脂质体（P＜0.05），以IC50计无糖脂阿霉素脂质体达到糖脂阿霉素脂质体相同杀伤率时所用剂量是糖脂脂质体的24倍。糖脂阿霉素脂质体对靶细胞SMMC－7721的杀伤作用与游离阿霉素相似，是因为阿霉素为脂溶性和水溶性的兼性药物，体外与细胞接触时间越长，非特导吸收的量越大；同时也说明阿霉素包入脂质体后仍保存其药理活性。0.5h处理实验在接近体内条件时，半乳糖脂阿霉素脂质体对人肝癌细胞系的杀伤作用优于游离阿霉素（P＜0.05），以IC50计游离阿霉素达到糖脂阿霉素脂质体相同杀伤率时所用剂量是糖脂脂质体的11倍。
(2)半乳糖脂阿霉素脂质体杀伤作用的特异性：48h细胞毒结果表明半乳糖脂阿霉素脂质体对人肝癌细胞系的杀伤作用与无糖脂阿霉素脂质体相比差异有显著性（P＜0.05），但对非靶细胞B16黑色素瘤细胞作用两者相近（P＞0.05）。0.5h预处理细胞毒实验，在缩短药物与细胞接触时间后，游离阿霉素对肝癌细胞系和B16黑色素瘤细胞的杀伤率均下降，而半乳糖脂阿霉素脂质体对肝癌细胞系仍保持较高杀瘤活性，对B16黑色素瘤细胞的杀伤率降低，半乳糖脂阿霉素脂质体对靶细胞和非靶细胞杀伤率相比差异有显著性（P＜0.05）。对非靶细胞B16黑色素瘤细胞半乳糖脂组不及游离阿霉素作用强，可能是由于阿霉素被脂质体包裹后其细胞吸收率不及游离阿霉素强，可能两者的吸收机制不同，有待进一步探讨。
(3)杀瘤的高效性：48h细胞毒实验结果表明在阿霉素浓度为10μmol/L时，半乳糖脂阿霉素脂质体对人肝癌细胞的杀伤率达89.1％，而非糖脂脂质体仅为51.6％，两者相比差异有显著性（P＜0.05），但对非靶细胞的杀伤率二者相近，分别为49.7％和50.3％。0.5h预处理细胞毒实验，在阿霉素浓度为10μmol/L时，半乳糖脂阿霉素脂质体对人肝癌细胞的杀伤率仍高达63.5％，而非半乳糖脂修饰的阿霉素脂质体仅为15.7％，说明糖脂脂质体对肝癌细胞有高效杀伤作用。
以上结果表明半乳糖脂阿霉素脂质体不仅减少了阿霉素的用量，降低其毒副作用，提高了杀伤率，而且半乳糖脂阿霉素脂质体无免疫原性，自身无毒、无药理作用，可以生物降解，也适合体内应用。所以半乳糖脂阿霉素脂质体经过动物试验，可望用于人肝癌导向治疗。
基金项目：国家自然科学基金资助(编号：39070251)
参考文献
1 Goldber eP. Targeted Drugs〔M〕.New york：Chicher, brisbane,Toronto, Singapore：Kohniley＆ Son,1983：1.
2 Yang yX, Duan FL. In vtro antitumor activity of activated peritoneal mcrophages by gPS encapsulated within liposme in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.J gastroenter Hepatology, 1993,2(suppl)：88.
3 温守明.肝细胞半乳糖(H－Gal)受体导向药物的研究进展〔J〕.药学进展，1992，16(1)：1.
4 Saito s and Tsuchiya T. Synthesis of alkyl－thioglucopyranosides：a series of new nonionic detergent〔 J〕.Chem pharm Bull,1985,33(2)：503.
5 杨玉秀，段芳龄.灵芝多糖脂质体激活肝癌患者巨噬细胞抗癌作用的研究〔J〕.中华消化杂志，1997，17(1)：58.
6 万宛龙，苏德森，顾学裘.唐松草新碱多相脂质体139－2注射液的包封率测定〔J〕.沈阳药学院学报，1988，5(1)：11.
7 郑永唐，贲昆龙.测定细胞存活和增殖的方法的建立〔J〕.免疫学杂志，1992，13(40)：266.
8 Ghosh pC, Bachhawat BK.Targeting of liposomes to hepatocytes〔J〕.Targeted diagn Ther,1991,4： 87.
收稿日期：1998－02－05；修回日期：1999－01－05
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