B7-1和IL-12基因转染对肝癌细胞免疫原性的影响

中国普外基础与临床杂志 2000年第4期第7卷 基础与实验研究

作者：吕明德　郑云　黄嘉凌　萧定璋　李树浓

单位：中山医科大学病理生理教研室　广州　510080

　　关键词： B7-1基因；白细胞介素12；肝肿瘤；免疫疗法；基因转染

　　【摘要】　目的　观察B7-1和IL-12基因表达对人肝癌细胞免疫原性的影响。方法　分别将B7-1和IL-12基因以逆转录病毒介导转染HepG2细胞。阳性克隆细胞与健康人外周血淋巴细胞(PBL)混合培养后，用流式细胞仪检测PBL表面Ⅰ类人白细胞抗原(HLA-Ⅰ)分子表达，以MTT法检测PBL的特异性杀伤活性及杀伤K562细胞的活性。结果　混合培养后HepG2/B7-1和HepG2/IL-12细胞组PBL表面的HLA-Ⅰ分子表达分别较HepG2/neo细胞组增加16.95%和14.71%(P＜0.05)； 与HepG2/neo组比较，HepG2/B7-1组PBL特异性杀伤活性增高12.5%(P＜0.05)，HepG2/IL-12组PBL的特异性杀伤活性无明显增高(P＞0.05)。HepG2/B7-1、HepG2/IL-12细胞活化的PBL对K562细胞的杀伤活性较HepG2/neo组分别增高19.38%和14.78%(P＜0.05)。结论　B7-1和IL-12分子均能增强免疫细胞对肝癌细胞的识别和杀伤，从而有效增强肝癌细胞的免疫原性。

　　【中图分类号】　R735.7； R392.11　　　【文献标识码】　A

　　【文章编号】　1007-9424(2000)04-0208-03

IMMUNE RESPONSES INDUCED BY HepG2 CELLS EXPRESSING B7-1 OR IL-12 MOLECULES

LÜ ming-de，ZHENG Yun，HUANG Jia-ling

　　（Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of B7-1 and IL-12 gene expression on the immunogenicity of hepatocellular carcinoma(HCC) HepG2 cells. Methods　Plasmids encoding B7-1 and IL-12 molecules were retrovirally introduced into human HCC cells,empty vector as control. PBLs were cocultured with HepG2/B7-1,HepG2/IL-12 and HepG2/neo cells. Three days later,PBLs were submitted to specific cytotoxicity test and nonspecific cytotoxicity test against K562 cells by MTT assay.Results　 HLA-Ⅰ molecules on PBLs were detected by FACS.HLA-Ⅰ molecules expressing on PBL cocultured with HepG2/B7-1,HepG2/IL-12 cells were enhanced by 16.95% and 14.71% than those of HepG2/neo group, respectively(P＜0.05). Specific cytotoxicity against HepG2/B7-1 cells was 12.5% higher than that of against HepG2/neo cell,while no increase in that of against HepG2/IL-12 cells. Cytotoxicities against K562 cells in HepG2/B7-1,HepG2/IL-12 groups were 19.38% and 14.78% higher than those of HepG2/neo group, but no significant difference between the first two groups. Conclusion　B7-1 and IL-12 gene transfer could remarkably promote immunogenicity of hepatocellular carcinoma cells and induce strong specific and nonspecific immunity against hepatocellular carcinoma in vitro.

　　【Key words】　B7 gene　　Interleukin 12　　Liver neoplasm　　Immunotherapy　　Gene transfer

　　B7分子的表达可提高T淋巴细胞对肿瘤抗原的敏感性，并可增强细胞毒T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞的杀伤效应，在基因治疗中应用广泛^〔1〕，但B7分子的共刺激作用的发挥又受到主要组织相溶性Ⅰ类抗原(MHC-Ⅰ)等因素的限制^〔2〕。IL-12可活化T淋巴细胞和NK细胞，产生CTL，是抗瘤作用很强的细胞因子^〔3〕，但B7和IL-12基因转染治疗肝癌的研究尚未见报道。本研究旨在通过将B7和IL-12基因导入肝癌细胞，观察B7和IL-12表达对肝癌细胞免疫原性的影响，为肝癌的基因治疗提供实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　人B7-1基因表达载体LhB7SN由意大利Dr. Mario P. Colombo惠赠； 小鼠IL-12基因表达载体IL-12-BIA/pbsⅡks(-)-HY由日本Hiroshi Yamamoto惠赠。空载体pLXSN、JM107菌株、PA317细胞、NIH3T3及K562细胞均由陈永雄博士惠赠。人肝癌细胞HepG2从上海细胞生物研究所引进。

　　内切酶、DOSPER、DIG标记与检测试剂盒、G418均购自Beohringer mannheim公司； FITC标记的鼠抗人CD80单抗及HLA-A、B、C单抗购自Pharmingen公司。流式细胞仪为Coulter公司产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1制备质粒^〔4〕　以JM107菌株大量扩增，以碱裂解法提取质粒DNA，内切酶鉴定。

　　1.2.2HepG2细胞转染　按DOSPER转染试剂盒说明，分别将LhB7SN和IL-12-BIA/pbsⅡks(-)-HY转入PA317细胞，以空载体转染作对照，阳性克隆分别命名为PA317/B7-1、PA317/IL-12和PA317/neo，NIH3T3法测得前两者的培养上清病毒滴度分别为3×10⁵和1.2×10⁵ CFU/ml。将三者病毒液稀释5倍，各取1 ml分别感染HepG2细胞，G418筛选后获得阳性克隆，命名为HepG2/B7-1、HepG2/IL-12和HepG2/neo。

　　1.2.3目的基因表达的检测　按单抗说明书，用FITC-CD80单抗在室温下标记阳性克隆细胞，流式细胞仪检测B7-1表达。用低溶点琼脂糖回收目的基因片段，按DIG标记与检测试剂盒说明制备B7-1和IL-12 DNA探针。以碱裂解法提取阳性克隆细胞DNA，与B7-1和IL-12 DNA探针进行斑点杂交。

　　1.2.4混合肿瘤-淋巴细胞培养　用密度梯度离心法分离健康人外周血淋巴细胞(PBL)。肝癌细胞接种于24孔板，待长至50%融合时加入等量PBL，培养3天后收集PBL，用流式细胞仪检测其表面Ⅰ类人白细胞抗原(HLA-Ⅰ)表达。

　　1.2.5特异性杀伤试验^〔5〕　在96孔板接种阳性克隆细胞，贴壁后加入按1.2.4步骤活化的PBL，效/靶为20∶1。

　　1.2.6对K562细胞的杀伤　靶细胞为K562细胞，同上操作。

　　1.3　统计学处理

　　实验数据以±s表示，采用t检验，检验水准α＝0.05(双侧)。

　　2　结果

　　2.1　质粒的制备和鉴定

　　本研究制备的B7-1和IL-12质粒的OD260/OD280分别为1.86和1.84。酶切鉴定结果与提供的资料相符。

　　2.2　目的基因表达的检测

　　流式细胞仪分析结果表明，HepG2/B7-1表达B7-1分子，HepG2/IL-12和HepG2/neo无B7-1分子表达(见附图)。斑点杂交显示，HepG2/B7-1 DNA与B7-1探针、HepG2/IL-12 DNA与IL-12探针均呈阳性反应； HepG2/neo DNA与两个探针均呈阴性反应。表明目的基因已整合到HepG2 DNA中并被表达出来。

附图流式细胞仪检测肝癌细胞表面B7-1分子表达

　　2.3　混合培养后PBL表面HLA-Ⅰ的表达

　　PBL分别与HepG2/B7-1和HepG2/IL-12混合培养后，PBL表面HLA-Ⅰ类抗原表达分别较HepG2/neo组增加16.95%和14.71%(P＜0.05)，但HepG2/B7-1与HepG2/IL-12细胞组间比较差异无显著性意义(P＞0.05，表1)。表明B7-1和IL-12分子能明显增强淋巴细胞的HLA-Ⅰ类抗原表达，两者作用相近。

表1　3种HepG2阳性克隆细胞刺激后PBL的HLA-Ⅰ类抗原表达(x±s)

　　与HepG2/neo组比较， *P＜0.052.4　特异性杀伤实验

　　在特异性杀伤实验中，HepG2/B7-1组杀伤活性较HepG2/neo组增加12.5%(P＜0.05)，但HepG2/IL-12组杀伤活性与HepG2/neo组比较无明显改变(P＞0.05)。在K562细胞的非特异性杀伤实验中，与HepG2/neo组比较，HepG2/B7-1和HepG2/IL-12组杀伤活性分别增强19.38%和14.78%(P＜0.05)，但后二组杀伤活性比较差异无显著性意义(P＞0.05，表2)。

表2　3种HepG2阳性克隆细胞刺激后PBL的杀伤活性(x-±s)

　　与HepG2/neo组比较， *P＜0.053　讨论

　　不表达B7分子是肿瘤细胞逃避免疫杀伤的重要机理之一。肝癌细胞能表达高水平的HLA-Ⅰ类分子，具有较强的抗原提呈能力，但因缺乏B7分子表达，肝癌细胞的免疫原性很弱^〔6〕。本研究中HepG2细胞不表达B7-1分子，HepG2细胞转染B7-1基因后获得较强的B7-1分子表达，其促进淋巴细胞活化及特异性和非特异性杀伤的能力大大增强。表明B7-1分子是抗肝癌免疫淋巴细胞活化和杀伤的重要影响因素，从而印证了T淋巴细胞活化的双信号理论。

　　本研究中，肿瘤细胞活化的PBL杀伤该肿瘤细胞反映的是特异性杀伤效应，针对K562细胞的则是非特异性杀伤活性。在B7-1分子参与下，PBL杀伤肝癌细胞和K562细胞的活性均大幅度增强，说明B7-1基因转染能同时增强免疫细胞的特异性杀伤和非特异性杀伤活性。这对防止肝癌的复发和转移无疑具有十分重要的意义。

　　IL-12既能活化T淋巴细胞也能活化NK细胞，同时激活特异性和非特异性免疫杀伤^〔7〕。本实验中我们观察到，HepG2细胞转染IL-12基因后刺激淋巴细胞HLA-Ⅰ类分子表达及杀伤K562细胞的活性大大增强，IL-12基因转染组和B7-1基因转染组杀伤K562细胞的活性无差别，表明IL-12基因转染能诱导淋巴细胞的活化和非特异性杀伤活性，T淋巴细胞和NK细胞均被活化，IL-12活化NK细胞的能力与B7-1分子相当。但在特异性杀伤试验中并未观察到IL-12基因转染组活性增强，IL-12基因转染组活性甚至还低于B7-1基因转染组。究其原因，可能有三： ①IL-12免疫活化作用小于B7-1。CTL细胞的活化主要受限于B7-1分子表达。B7-1通过提供共刺激信号活化T淋巴细胞，IL-12则直接刺激T淋巴细胞，二者作用机理不同导致效力不同。②靶细胞敏感性不同。K562细胞为血液肿瘤细胞，对淋巴细胞高度敏感，而HepG2细胞为实体瘤细胞，不易为淋巴细胞杀伤。③种属差异。本研究采用的是小鼠IL-12和人B7-1基因，靶细胞则为人肝癌细胞。虽然人IL-12和小鼠IL-12的p53基因有60%同源性，p40基因有70%同源性，小鼠IL-12可作用于人淋巴细胞^〔8〕，但两者之间毕竟存在着种属差异，从而可能影响鼠IL-12免疫效应的发挥。具体原因尚待进一步研究，如果采用同源IL-12基因进行研究，则有可能获得更好的结果。

　　本研究还显示，PBL与HepG2/B7-1、HepG2/IL-12细胞混合培养后，HLA-Ⅰ类抗原表达较对照组显著增强。MHC-Ⅰ类抗原分子在免疫应答及免疫调节中是一类关键分子，参与肿瘤抗原的呈递及淋巴细胞的活化和杀伤效应^〔9〕。肿瘤在浸润和转移过程中多有MHC-Ⅰ类抗原分子的丢失^〔10〕，直接转染MHC基因可提高黑色素瘤细胞的免疫原性^〔11〕。另有研究表明，肿瘤细胞转染B7基因诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)有赖于MHC-Ⅰ类抗原分子的适当表达^〔12〕。因此，MHC-Ⅰ类抗原分子在抗肿瘤免疫中起重要作用。研究中我们发现，B7-1和IL-12基因转染使淋巴细胞HLA-Ⅰ类分子表达增强，从功能的意义上说，HLA-Ⅰ类分子表达增加有助于促进淋巴细胞间的相互识别和相互作用，从而增强肿瘤免疫。

　　结论： B7-1和IL-12基因转染均能促进淋巴细胞的活化和对肝癌细胞的杀伤作用，增强肝癌细胞的免疫原性。

　　【基金项目】　广东省自然科学基金资助项目(资助号： 970066)

　　【作者简介】　吕明德(1951年-)，男，河南淮阳人，教授，博士生导师，主要从事肝癌治疗的研究。

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(1999-07-07收稿，1999-12-16修回)