健脾理气合剂阻抑小鼠HBV协同AFB1致肝癌的机制
世界华人消化杂志 1998年第7期第6卷 研究原著
作者：吴万垠1 钱耕荪2 于尔辛3
单位：广州中医药大学第二附属医院肿瘤科 广东省广州市 510120;2上海市肿瘤研究所 200032; 3上海医科大学肿瘤医院 200032
关键词：党参/治疗应用；白术/治疗应用；茯苓/治疗应用；肝肿瘤，实验性/预防和控制；乙型肝炎病毒；黄曲霉毒素类/分析；肝肿瘤，实验性/病因学
inhibitory effect of Jianpi Liqi mixture on enhanced hepatocar-cinogenesis of aflatoxin B1 in HBV transgenic mice
WU Wan-Yin1, QIAN Geng-Sun2 and YU Er-Xin3
1Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
2Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032, China
3Cancer Hospital of Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
Subject headings liver neoplasms, experiment/etiology; liver neoplasms, experiment/prevention and control; aflatoxin B1; hepatitis B virus; codonopsis pilosula; atractylodes macrocephala
Abstract
AIM To elucidate the mechanism of inhibition of Jianpi Liqi mixture (JPLQ) on enhanced hepatocarcinogenesis of aflatoxin B1(AFB1) in HBV transgenic mice.
METHODS Fifty G3 HBV transgenic mice screened with the techniques of PCR and Southern blot, were divided into transgenic treatment group and transgenic control group. Twenty-five nontransgenic mice served as normal control group. When the mice were 10 weeks old, the treatment group were given orally 2.5g/kg JPLQ everyday for 15 days and two control groups were given same volume of saline. At the 16th day, the mice were intraperitoneally exposed to a single dose of 1mg/kg AFB1 (except the mice at 0h point). The mouse hepatic AFB1-DNA adducts were detected with RIA. The activities of phases Ⅰ and Ⅱ hepatic enzymes, which were associated with the metabolism of AFB1, were also tested.
RESULTS JPLQ decreased the increased hepatic AFB1-DNA adducts in HBV transgenic mice nearly to the levels of nontransgenic mice (nmol/g, 420±30,111±13; P＜0.01). It also increased the amounts of hepatic microsome P450 (μmol/g, 0.87±0.25 to 1.29±0.26, P＜0.05) and glutathione (nmol/g, 5.28±0.95 to 7.67±0.76, P＜0.01) and enhance glutathione S-transferase activity (mmol·L-1·min-1·g-1, 3.71±0.95 to 5.58±0.75, P＜0.01).
CONCLUSION Through affecting hepatic enzymes associated with the metabolism of AFB1, JPLQ can decrease the damage of hepatocellular DNA in HBV transgenic mice, and inhibit the synergistic hepatocarcinogenesis of HBV and AFB1.
中国图书资料分类号 R735.705.2 R735.702.31
摘 要
目的 探讨中药健脾理气合剂阻抑HBV与AFB1协同致肝癌作用机制.
方法 用PCR技术结合Southern杂交方法，筛选出50只G3代HBV转基因小鼠，分成两组：转基因治疗组与转基因对照组，另选择25只同龄非转基因小鼠作正常对照组. 小鼠10wk时，予治疗组小鼠，按2.5g/(kg·d)灌服健脾理气合剂，两对照组小鼠灌服等体积生理盐水共15d. d16，按1mg/kg ip AFB1 (0h相小鼠不注射). 用RIA法测定暴露AFB1后7个不同时相小鼠肝脏AFB1-DNA加成物的含量，并检测小鼠肝脏与AFB1代谢相关的两相酶系活性.
结果 健脾理气合剂能使HBV转基因小鼠暴露AFB1后1h(559±42)及24h(249±20)相升高的肝脏AFB1-DNA加成物水平(nmol/g)降至近正常水平(420±30，111±13；P＜0.01)，并能提高转基因小鼠肝脏P450(μmol/g，0.87±0.25→1.29±0.26，P＜0.05)，谷胱甘肽(nmol/g，5.28±0.95→7.67±0.76，P＜0.01)含量及激活GST活性(mmol·L-1·min-1·g-1，3.71±0.95→5.58±0.75，P＜0.01).
结论 健脾理气合剂通过作用于HBV转基因小鼠肝脏与AFB1代谢相关的Ⅰ相及Ⅱ相解毒酶系统，减少肝脏DNA损伤，阻抑HBV与AFB1协同致肝癌作用.
0 引言
以党参、白术、茯苓、八月扎等组制的健脾理气合剂在临床与实验研究方面均已显示了对原发性肝癌的防治作用［1］. 我们在探讨了与肝癌发生密切相关的两个主要病因：乙型肝炎病毒(HBV)与黄曲霉毒素B1(AFB1)协同致肝癌的基础上［2］，对该合剂阻抑这两个致病因子的协同致肝癌机制进行了研究.
1 材料和方法
1.1 材料 HBV转基因小鼠(HBVTGM)由江苏省农学院哺乳动物胚胎工程和遗传工程实验室提供. 由ICR品系小鼠经微注射含HBV(adr)全基因组质粒制作G2代雄鼠［3］同正常同品系雌鼠交配，出生的后代，于2月龄时，从眼底采血50μL～80μL，分离血清. 取20μL血清，加20μL处理液(1.0m/L KCl， 0.5mol/L Tris. HCl， pH 8.3，0.1mol/L MgCl2，4.5g/L NP40, 4.5g/L Tween20,3g/L pronase K)经55℃×30min，95℃×10min，10 000r/min×5min离心， 取上清液作为DNA模板，用合成的位于HBVDNA C区的一对引物进行PCR扩增［4］. 取1/10产物用于15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 随后进行Southern转膜并以32P a-dCTP标记的HBVDNA探针进行分子杂交和放射自显影［4］. 其中，血清HBVDNA阳性的小鼠被选作实验用. 正常2月龄ICR品系小鼠购于上海市计划生育研究所. 健脾理气合剂按以前的组成及方法制成［1］，每mL含生药0.25g. AFB1单抗、3H-AFB1由Kensler教授(USA)惠赠. AFB1、小牛胸腺DNA(CTD)、小鼠血清及马血清等均为Sigma产品. 细胞色素C、二硝基氯苯、还原型谷胱甘肽(GSH)等购于市售. UV-300型紫外分光光度计，Shimadzu产；WALLAC1409型液闪计数仪，LKB公司产品.
1.2 方法 选择25只正常ICR小鼠作为正常对照组，50只血清HBVDNA(+)转基因小鼠随机分成两组，转基因中药组与转基因对照组，各25只. 于10wk时，予中药组小鼠按2.5g/kg 灌服健脾理气合剂，予两对照组小鼠灌服等体积生理盐水，3次/d，共15d. d16，按1mg/kg予小鼠ip AFB1(0时相小鼠不处理). 之后，按0，0.5，1，2，4，8，24h 7个时相分别取3只小鼠(0，1h时相各2，8只)摘眼球采血并处死，迅速取肝脏经液氮冷冻后贮存于-70℃待检.肝脏AFB1-DNA加成物测定参照Wang et al［5］方法改进 ①DNA抽提 取小块肝组织放入液氮中冻脆，取出置研管中，研成粉末，移至50mL离心管中，加组织裂解液5mL，pronase K 50mg/L，50℃×3h，充分消化后，分别用酚及酚：氯仿抽提1次，酒精沉淀后，挑出沉淀挥干，加入1.5mL TE(10∶1)充分溶解. 再用RNA酶纯化后，溶于蒸馏水中待定量. ②DNA定量 吸取2μL DNA样品，加水至1mL，混匀后，转入紫外分光光度计的石英比色杯中，先调零，在260nm处读出OD值. 最后，根据OD值计算DNA样品的浓度. ③RIA法样品DNA中加入1mol/L盐酸(体积分数50∶9)，95℃×20min，再加入等体积1mol/L甲酸铵. 预先绘制AFB1单抗标准阻抑曲线. 取100μg经变性DNA样品加PBS，使总体积均为200μL，加入用100mL/L马血清/100mg/L cTD/PBS稀释至50%阻抑滴度的抗体，再加入100μL 3H-AFB1(1～1.2)×104min-1，混匀，室温置2h，加300μL饱和硫酸铵，混匀后置室温15min，12000r/min离心15min，取300μL上清加入盛有10mL闪烁液的液闪瓶中，盖紧混匀后于液闪计数器上测cpm值. 计算各样品阻抑率，在半对数坐标纸上绘制浓度-阻抑率曲线，测计各样品中的同DNA结合AFB1浓度，再根据样品的体积及DNA量计算出每mg DNA中形成的AFB1-DNA量. 所有样品均测两次，取平均值. 1h相小鼠肝脏细胞色素P450含量测定参照Omura方法. 1h相小鼠肝脏谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性测定按Habig法，肝组织GSH含量测定按Ellman法.
统计学处理 采用方差分析及t检验.
2 结果
2.1 肝脏AFB1-DNA加成物水平 健脾理气合剂ip AFB1后，各组小鼠肝脏AFB1-DNA的水平总体变化趋势基本一致：0.5h即开始上升，1h左右达高峰，其后逐渐下降，总体反映了小鼠对AFB1快速代谢及解毒作用(表1). 但HBVTGM组显示了增强AFB1致肝细胞DNA损伤作用，即高峰时相值明显高于正常小鼠组，24h后仍维持较高水平，而健脾理气合剂则能拮抗HBVTGM组的增强AFB1致肝细胞DNA损伤作用，表现为使高峰时相及24h相值降低至近正常小鼠水平.
表1 健脾理气合剂对HBVTGM暴露AFB1后肝脏AFB1-DNA加成物的影响 (nmol/g, 
±s)
| 时相(h) |
n |
正常对照组 |
转基因对照组 |
转基因治疗组 |
| 0 |
2 |
96±8 |
115±17 |
97±16 |
| 0.5 |
8 |
340±18 |
407±26 |
349±22 |
| 1 |
3 |
414±28 |
559±42a |
420±30b |
| 2 |
3 |
382±32 |
424±40 |
380±40 |
| 4 |
3 |
274±15 |
365±42 |
274±29 |
| 8 |
3 |
170±22 |
268±30 |
170±25 |
| 24 |
3 |
99±8 |
249±20a |
111±13b |
〖JP2〗aP＜0.01 vs 同时相正常对照组小鼠；bP＜0.01 vs 同时相转基因小鼠.
2.2 HBVTGM肝脏代谢AFB1解毒功能 转基因小鼠同正常小鼠相比，肝脏对AFB1代谢解毒的两相酶系活性均降低. 健脾理气合剂对两相酶系活性均有一定的诱导作用：诱导Ⅰ相解毒酶(细胞色素P450)使小鼠对AFB1代谢成终致癌物的能力加强，与对照组比差异显著(表2，P＜0.05). 对Ⅱ相解毒酶系(GST，GSH)功能的激活则增强小鼠肝脏对终致癌物的结合解毒功能.
表2 健脾理气合剂对HBVTGM肝脏代谢AFB1的作用 (n=8,±s)
| 组 别 |
肝蛋白 P450
(μmol/g) |
肝蛋白 GST
(mmol·L-1·min-1·g-1) |
肝组织 GSH
(nmol/g) |
| 正常对照组 |
1.48±0.31 |
5.95±0.81 |
8.03±0.83 |
| 转基因对照组 |
0.87±0.25a |
3.71±0.95a |
5.82±0.95a |
| 中药治疗组 |
1.29±0.26c |
5.58±0.75b |
7.67±0.76b |
aP＜0.01，vs 正常对照组小鼠；bP＜0.01，cP＜0.05，vs 转基因对照组小鼠.
3 讨论
HBV慢性感染与AFB1暴露被认为是导致原发性肝癌的两个主要危险因素. 流行病学及动物实验研究结果提示［6，7］，二者具协同致肝癌作用. 由于HBV感染具有严格的种属特异性，多年来一直缺乏理想的人HBV感染动物模型. 微注射转基因技术建立的HBV转基因小鼠模型，为研究HBV致肝癌提供了较好的工具. 在Sell et al［7］进行的AFB1对HBV转基因小鼠致肝癌研究中，HBV使小鼠对AFB1致肝癌敏感，而AFB1则使转基因小鼠肝癌的发生时间提前. 显示了明显的协同致肝癌的机制进行了探讨. 从AFB1前致癌物在体内的代谢活化致癌途径，我们的实验结果提示，HBV转基因小鼠肝脏病变使得其对AFB1的活化能力减弱，同时对终致癌物的结合解毒能力降低，使体内产生过多的AFB1-DNA加成物、DNA损伤超过其修复能力可能是协同致肝癌的主要机制.
较多的临床及实验研究已提示，健脾理气合剂对原发性肝癌的发生具防治作用［1］. 早年许凯黎et al［8］的研究曾提示，该合剂对肝癌的高危人群的肝癌发生具阻断作用. 本实验中，我们对该合剂阻抑HBV与AFB1协同致肝癌的机制进行了探讨. 结果提示，该方能诱导与AFB1代谢相关的两相酶系功能：使前致癌物AFB1快速代谢为终致癌物(AFB1-8，9-环氧化物)，缩短在体内储留时间；同时激活Ⅱ相解毒酶系功能(GST，GSH等)，使终致癌物结合解毒为无毒产物，减少AFB1-DNA加成物形成及DNA损伤，最终可望降低肝癌的发生几率. 该项研究结果初步揭示了健脾理气合剂阻断HBV与AFB1协同致肝癌的可能机制. 该合剂最终是否能阻断HBV与AFB1协同致肝癌的发生正在进一步研究中. 在临床上，开展中药对HBV感染的肝癌高危人群的肿瘤预防将是一个很好的课题.
4 参考文献
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8 许凯黎，李明烈，关赛芳，于尔辛. 血清AFP低浓度对象临床研究. 中华肿瘤杂志，1980；
2(1)：45-491
吴万垠，男，1964-08-10生，安徽省和县人，汉族. 1986年安徽中医学院本科毕业，1992年上海中医药大学硕士，1997年上海医科大学博士，1997年至现在为广州中医药大学博士后，副教授，主要从事肝癌的中西医结合防治研究，发表论文18篇.
通讯作者 吴万垠，510120，广州中医药大学第二附属医院肿瘤科，广东省广州市大德路111号.
Correspondence to:WU Wan-Yin, Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University, 111 Dadelu, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
收稿日期 1998-04-22
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