肝癌细胞稳定转染B7.1后的免疫学特性
细胞与分子免疫学杂志 2000年第2期第16卷 肿瘤免疫学
作者：李增山 隋延仿 叶菁 郭爱林
单位：李增山（第四军医大学病理学教 研室肿瘤抗原肽实验室,陕西西安710032）；隋延仿（第四军医大学病理学教 研室肿瘤抗原肽实验室,陕西西安710032）；叶菁（第四军医大学病理学教 研室肿瘤抗原肽实验室,陕西西安710032）；郭爱林（第四军医大学病理学教 研室肿瘤抗原肽实验室,陕西西安710032）
关键词：肝癌细胞；B7.1；共刺激
摘要：目的 探讨赋予肝癌细胞第二信号分子B7.1、增强癌细胞与淋巴细胞之间的识别与激活作用，从而达到增强淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤或抑制作用。方法 利用逆转录方法，转染B7.1分子至包装细胞系PA317。筛选获得高滴度的克隆后，以病毒上清感染肝癌细胞，使其表达B7.1分子，最后以LDH释放法测定LAK细胞的细胞毒活性。结果 肝癌细胞可稳定表达B7.1分子，阳性率达94.3％，未转染的细胞无表达；其所诱发的LAK细胞的细胞毒活性明显强于未转染的肝癌细胞组(P∨0.01)。结论 B7.1分子在淋巴细胞与癌细胞之间的识别过程中起着重要作用，可介导淋巴细胞对癌细胞的粘附和识别，从而增强淋巴细胞的杀伤作用。这一结果可为今后进一步深入研究B7.1的作用机制，以及与其它细胞因子、粘附分子的相互作用打下基础。
中图号：R735.7R392.12 文献标识码：A
文章编号：1007－8738(2000)02－0148－04
Pilot study of immunoreactivity on B7.1 gene transfecting hepatocarcinoma cells
LI Zeng- shan SUI Yan- fang YE Jing， GUO Ai- lin
（Department of Pathology， the Fourth Military Medical University， Xi'an 710032, Shaanxi Province， China ）
Abstract： Aim To study costimulation mediated by costimulatory molecules, B7- 1, counter- receptor ligands for the CD28/cytolytic T lymphocyte associated antigen(CTLA)- 4, which plays an important role in the induction of T cell- mediated antitumor immunity against HCC. Methods Retroviral transduction was applied in transfecting pLXSN- B7.1 into packaging cell line,PA317, and high- titer clone was acquired. Then the virus stock were used to infect the HHCC cell lines and the clone strongly expressing B7.1 was picked out. At last the primary LAK cytotoxicity were processed through the method of LDH release. Results After transfection, HHCC cell line could express B7.1 steadily. The introduction of B7.1 into HHCC cells in vitro induced a strong immunity that was associated with LAK cells in contrast to the untransfected cells in which B7.1 was not expressed (P∨ 0.01). Conclusion Our findings suggest that B7- 1 gene transfer is an appropriate way to induce strong expression of this molecule and enhance the recognition by LAK cells. This might be useful for studying the B7.1 molecular more thoroughly and for immuno-gene therapy against human HCC.
Keywords: HCC； B7.1； costimulation
肿瘤细胞的杀伤主要依赖于T细胞的激活，目前的研究表明，T细胞的激活依赖于两方面的刺激:①通过TCR介导的抗原特异性刺激；②通过抗原提呈细胞传送的非抗原特异性第二信号的刺激。如果第二信号缺失，会导致T细胞克隆的无反应性或凋亡[1,2]。B7.1（CD80）是目前研究最为广泛的共刺激信号分子。已有一些研究表明，转染B7.1基因的肿瘤细胞可对CD8＋T或CD4＋T细胞产生直接共刺激作用，而导致肿瘤细胞被杀伤或抑制[3－5]，但肝癌细胞B7.1基因的表达多低下或缺如，成为肝癌细胞逃逸免疫排斥反应的一个重要原因[6]。在上述理论的基础上，我们将B7.1基因通过包装成逆转录病毒的方法，转染至肝癌细胞系（HHCC），以增强其刺激T淋巴细胞时的第二信号，为 改进肝癌免疫基因的治疗提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料 逆转录病毒载体pLXSN-B7由本室保存。逆转录病毒包装细胞系PA317，为本校唐都医院骨肿瘤实验室张惠中博士惠赠。肝癌细胞系HHCC由本室保存。上述细胞均在含100mL/L新生牛血清的DMEM（高糖）培养基，37℃50mL/LCO2条件下培养。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒的包装及转导 质粒pLXSN－B7经脂质体lipofectamine（Gibco）介导转染至病毒包装细胞系PA317中，经G418（500mg/L）筛选出阳性转染细胞，克隆化得到单克隆。取每个克隆的培养上清5mL（约含逆转录病毒2～3μg)感染PA317细胞，并进行滴度测定。测定滴度前1d，将待测细胞NIH3T3做1∶10稀释后接种。测定滴度的当天，将待测NIH3T3细胞的培养基更换为PA317细胞的培养上清，感染时间为2h。然后更换为正常培养基，培养48～72h后，取1/15接种于两个8cm的平板，更换成选择培养基（G4181g/L），每4d更换液体1次。到第11～12天，计数平板上的克隆，得到高滴度克隆后，按下列公式测定滴度：
G418-R(103cfu/L)=克隆数/病毒上清量(L)×细胞复制周期数
×NIH3T3细胞稀释倍数
取高滴度克隆的培养上清5mL（约含病毒0.1～0.01mg/L）转导肝癌细胞，方法同滴度的测定。转导后的肝癌细胞经克隆 化筛选出单克隆。
1.2.2 阳性克隆的筛选 将经感染后筛选出的单克隆扩大培养后做FCM检测，确定阳性克隆。小鼠抗人CD80mAb（1∶100稀释）和FITC-羊抗鼠IgG/M（1∶100稀释），均为PharMingen公司的产品（购自晶美公司）。阳性对照抗体用肝癌特异性mAbHAb18(本校863 课题组提供),阴性对照为不加一抗。
1.2.3 LAK细胞的诱导及细胞毒活性的测定 ①LAK细胞的诱导:取肝癌患者外周血常规分离淋巴细胞，置入含200mL/L新生牛血清的DMEM中培养，并加PHA(10mg/L)和IL-2(1×105U/L)（华美公司产品）。扩大培养后，调整细胞密度为4×107/L，于6孔板中每孔加入淋巴细胞2.5×10－3/L及丝裂霉素灭活的肿瘤细胞1mL(1×107/L)，培养5d。②LAK细胞的细胞毒活性测定〔7〕：采用LDH释放法。同时，测定转染B7.1基因前后的HHCC细胞，效靶比(E/T)分别为100∶1，25∶1及1∶1。培养6h后，用全自动生化分析仪(Beckman公司产品)测定LDH活性（1×103IU/L），并按下 列公式计算LAK细胞的杀伤活性。
统计学处理：采用SSPS软件对所得资料进行t检验。
2 结果
2.1 pLXSN-B7的包装及滴度测定 PA317细胞经pLXSN-B7转染并克隆化，挑选出21个单克隆，依次编号为：pb1，2，3……21。滴度测定表明，pb4和pb17为阳性克隆，滴度分别约为2.5×107～2.5×108cfu/L和2.3×104～2.3×105cfu/L，遂确定pb4为以下实验所用 的pLXSN-B7转染的阳性细胞。
2.2 B7.1基因的表达 将pb4培养上清感染的肝癌细胞株HHCC，经G418筛选并克隆化，得到12个单克隆，依次命名为HHCC-PB-1，2，3……12。经流式细胞仪检测确定，HHCC-PB-2，3，5，7和
9号为表达B7.1基因的阳性克隆，其中HHCC-PB-2号的阳性细胞率达94.3％，未转染的细胞无B7.1基因的表达（图1）。
图1 B7.1基因表达的FCM分析
Fig1 Flow cytometric analysis of B7.1 gene expression
2.3 LAK细胞的细胞毒试验 将肝癌细胞与肝癌患者的外周血淋巴细胞混合后，可有效地刺激淋巴细胞增殖。经IL-2刺激后所获肿瘤特异性LAK细胞，以100∶1，25∶1和1∶1的效靶比，与转染B7.1基因前后的HHCC混合培养。混合后4h，开始出现明显的杀伤作用；6h后镜下可见表达B7.1的肝癌细胞大部分被杀死， 死亡的癌细胞从培养瓶壁上脱落，聚集成团，与淋巴细胞混合在一起。死亡细胞的形态大致呈圆形，但胞膜极不规则，胞浆浓缩，胞核色深，尚可见大量细胞碎片(图2)。我们还观察到，效靶细胞相互作用的动态过程，即部分淋巴细胞逐渐趋向癌细胞，随后两者的胞膜接触，癌细胞的膜发生变形，呈从瓶壁上脱落的趋势。未转染的细胞也有部分被杀死，并且少量细胞出现分裂像。混合培养6h后，以所测定的LDH的释放量(103IU/L）计算杀伤率，结果如图3。在3个试验组中，转染B7.1基因的HHCC细胞的杀伤率分别为43.2％，84.4％和89.2％，均高于未转染的HHCC细胞（P＜0.01）。
图2 LAK细胞对转染B7.1基因前后HHCC细胞的杀伤活性
Fig2 Cytotoxicity of LAK cells on HHCC and HHCC-B7.1cells
A：B7.1-HHCC cells cocultured with LAK cells for6h(×40);B：B7.1＋HHCC
cells cocultured with LAK cells for 6h(×40).
图3 LAK细胞对HHCC和HHCC-B7细胞的细胞毒活性
Fig3 The cytotoxicity of LAK cells on HHCC and HHCC-B7 cells
with different E/T ratios
3 讨论
激活的B细胞、树突状细胞及巨噬细胞均有B7.1基因的表达。B7.1分子与其在T细胞和NK细胞表面的配体CTLA-4和/或CD28相互作用，可增强淋巴细胞对靶细胞和抗原提呈细胞的识别，导致T细胞增殖和一些细胞因子（IL-2，INF-γ，TNF-α和GM-CSF等）表达增高，进而大大增强淋巴细胞的杀伤作用[3－5]。肝癌细胞第二信号的缺失是使之逃逸免疫排斥反应的的一个重要原因。Tatsumi等[6]研究发现，7种肝癌细胞株B7.1基因的表达均很低，经INF-γ刺激后表达量虽有增加，但仍属低水平。我们的研究也发现，肝癌细胞B7.1基因的表达缺失或低下。早期在肝癌免疫治疗的探索性研究中，将肝癌细胞与激活的B细胞融合，以增强其刺激免疫应答的能力[8]。后来研究发现，经γ射线作用后机体对肝癌细胞的免疫应答增强，其中一个重要的原因在于照射后癌细胞B7分子的表达增加[9]。我们将B7.1基因转染至肝癌细胞，使其表达B7.1分子，提供第二信号，以增强癌细胞与淋巴细胞间的识别和激活作用，达到淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用。结果表明，转染B7.1基因后的肝癌细胞可诱发较强的免疫排斥反应。在细胞毒作用的实验中，LAK细胞对转染B7.1基因的细胞的杀伤率明显高于未转染者（P＜0.01）。另外，在其它肿瘤的研究中，发现转染B7.1基因的癌细胞在刺激淋巴细胞激活的过程中，一些细胞因子（如IL-2，IL-12和GM-CSF等）有很大的协同作用[10,11]。有关这些细胞因子与B7.1分子的协同，以及B7.1在肝癌细胞所诱导的免疫排斥反应中作 用的详细机制，尚待进一步阐明。
基金项目：国家自然科学基金资助，№.39770827
作者简介：李增山，男，28岁，博士生安市长乐西路17号，Tel.（029）3374541-211 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999－10－27
修回日期：1999－12－17
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