两种免疫方法用于制备抗肝癌NMPmAb的比较

细胞与分子免疫学杂志 1999年第2期第15卷 经验交流

作者：黄俊琪　刘乐和

单位：中山医科大学微生物学教研室，广州，510089

　　核基质(nuclear matrix,NM)是真核细胞核内的非组蛋白网架结构，与肿瘤的发生密切相关^〔1〕。肿瘤细胞具有特异性核基质蛋白(nuclear matrix protein,NMP)，因此，制备肿瘤特异性NMP的mAb具备潜在的应用价值^〔2〕。但NMP的提取较为复杂，且得率较低，对抗NMP mAb的制备带来一定的难度。为提高抗NMP mAb制备的成功率，本文用两种免疫方法制备抗肝癌NMP的mAb，发现用肝癌细胞纯核做基础免疫效果较好。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要材料　肝癌组织由本校肿瘤医院提供。正常肝组织由本校病理学教研室提供。胎肝组织由广州市妇婴医提供。SDS，HAT，HT，NP-40，PMSF和DAB等，均为Sigma公司产品；LSAB试剂盒为DAKO公司产品。

　　1.2　NMP的提取　肝癌、正常肝组织及胎肝组织NMP的提取，按文献〔3〕进行并稍加改良。提取时用非离子去污剂及高盐提取液进行处理。以紫外分光光度法测定NMP蛋白的含量。

　　1.3　肝癌细胞核的制备　肝癌细胞悬液经去污剂处理后，取少许，以甲基蓝染色镜检，可见细胞核几乎完全游离出来。先在离心管中缓慢加入含0.5mol/L蔗糖的缓冲液，体积为离心管体积的1/3；再缓慢加入细胞核悬液，以800g离心10min，悬浮，用紫外分光光度法测定蛋白含量。

　　1.4　免疫方法　方法一：基础免疫采用福氏完全佐剂与肝癌细胞纯核的混合物0.1ml(纯核蛋白的总浓度为150μg)腹腔注射；方法二：基础免疫用完全佐剂加肝癌NMP100μg。加强免疫都用肝癌NMP的PBS液0.1ml(含肝癌NMP100μg)。

　　1.5　mAb的制备　用ELISA法分别测定用两种免疫方法免疫的小鼠免疫血清的效价。并分离脾细胞与对HAT敏感的Sp2/0细胞(4∶1)进行融合，ELISA法筛选。同时检测培养上清对肝癌NMP及正常肝细胞NMP的反应性，选择对肝癌NMP呈强阳性反应而对正常肝细胞NMP无反应的阳性克隆，用有限稀释法进行克隆化，并以常规方法制备mAb腹水。

　　1.6　mAb的特性鉴定 ①效价测定：采用间接ELISA法；②mAb的Ig类、亚类的鉴定：采用琼脂糖双扩散法。③mAb的特异性鉴定：采用ELISA法检测mAb与HBsAg，HBeAg和AFP的交叉反应性；用免疫组化LSAB法，检测mAb与肝癌细胞、各种细胞片及组织冰冻切片的反应性，操作步骤参照LSAB试剂盒说明书。

　　2　结果

　　2.1　两种免疫方法制备mAb的效果比较　方法一：免疫血清的效价大于1∶10000；融合率为90％(346/384)，阳性率为5％(15/346),获得5株(1E1，2G8，3H11，4B9和4C9)能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞，其中2G8株对HCCNMP具有特异性。方法二：免疫血清的效价为1∶3200；融合率为88％(169/192)，阳性率为2％(4/169)，获得1株mAb，经检测发现其结合于肝癌的细胞浆。

　　2.2　mAb的特异性鉴定　①mAb2G8的效价、Ig类及亚类鉴定：用ELISA法测定2G8杂交瘤细胞培养上清及其制备的小鼠腹水中，mAb2G8的效价分别为1∶160和1∶25600；Ig类别为IgM，其轻链为κ型。②mAb2G8的特异性鉴定：ELISA法鉴定表明，mAb与HBsAg和HBeAg等HBV相关抗原及AFP均无交叉反应；LSAB法检查其与人的不同细胞、组织的反应性见表1。

表1　mAb2G8与人的各种细胞、组织的反应性

　　3　讨论

　　目前，利用杂交瘤技术制备针对强抗原的mAb已不成问题，但若抗原量甚微或抗原性甚弱时，制备其mAb尚有一定的难度。因此，探索良好的免疫方法以节省抗原并增强其抗原性和提高成功率，仍是许多实验室值得深入研究的目标。NM是基因表达的场所，与肿瘤的发生密切相关。肿瘤细胞具有特异性的NMP，因此，以其为免疫原产生的mAb可用于进行肿瘤的诊断和鉴别诊断，并可作为研究肿瘤发生、发展的重要工具。但NMP制备过程较繁琐，得率不高。为提高制备抗肝癌NMPmAb的成功率，本文采用了两种免疫方法，发现用肝癌纯核做基础免疫的效果较好，所获免疫血清的效价、融合率及克隆阳性率均较高，这可能与作为免疫原的肝癌细胞纯核能保持NM三维空间结构的完整性，使其抗原性增强有关。为免去细胞核中NMP以外成分对制备特异性抗NMPmAb的影响，我们在筛选时，用于包被的抗原则是较纯的肝癌NMP，并同时采用正常人肝细胞NMP作为对照进行同步筛选，以丢弃那些针对正常人肝细胞NMP的杂交瘤细胞株，保证了杂交瘤细胞分泌mAb的特异性，最终获得1株能稳定分泌抗肝癌NMP的mAb 2G8。ELISA检测发现，mAb 2G8与HBsAg和HBeAg等HBV相关抗原无交叉反应，与AFP也无交叉反应；并用LSAB法鉴定证实，该mAb可与肝癌细胞的核相结合。其与正常肝细胞和胎肝细胞的核均无交叉反应，与4种癌细胞和3种正常细胞的反应中，仅发现其与食管癌细胞核有较弱的阳性反应，表明mAb 2G8具有良好的特异性。

　　作者简介：黄俊琪，女，26岁，助教，硕士。广州市中山二路74号，Tel.(020)87333757

　　参考文献

　　［1］Kuzmina SN, Buldyaeva TV. Peculiarities of protein composition of nuclear matrixin sme tumors and cultures of embryonic fibroblasts of chnne hamster. Biochemistry, 1983; 48:844～850

　　［2］Keesee SK, Briggman JV, Thill G, et al. Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis. Crit Rev Eukargot Gene Expr, 1996; 6(2－3):189～214

　　［3］Wen BG, Chiu JF. Monoclonal antibodies to nonhistone proteins associated with human colon cancer nuclear matrix. Int J Biochem, 1987; 19:321～326

收稿：1998－07－22

　　修回：1998－10－16